Universität zu Köln

Chung, Yoon-Suk Alexander (2011). Characterization of Phagocytic Pattern Recognition Receptors in Drosophila melanogaster. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful model system to study innate immunity. Insects employ multilayered innate immune defenses including antimicrobial peptide responses and phagocytosis. In Drosophila, phagocytosis is carried out by plasmatocytes, a blood cell type similar to mammalian macrophages and neutrophils. The scavenger receptor Eater is expressed by larval and adult plasmatocytes and mediates recognition of a broad range of bacterial pathogens. Eater is required for fly survival after infection with Gram-positive and Gram-negative bacteria. However, the bacterial ligands of Eater, and the mechanisms by which this receptor recognizes these different types of bacteria, remain poorly understood. To address this problem, I generated a soluble, Fc-tagged receptor variant of Eater comprising the N-terminal 199 amino acids (including four N-terminal EGF-like repeats) and raised antibodies against Eater. Using these tools, I established (i) that Eater is expressed on the surface of macrophage-like Drosophila S2 cells, (ii) that it interacts with broad, yet distinct classes of heat- and ethanol-inactivated microbes and (iii) that it binds peptidoglycan from Gram-negative Proteobacteria (E. coli) and Gram-positive Firmicutes (E. faecalis and S. aureus), but not Gram-positive Actinobacteria (M. luteus). In order to identify genes involved in the phagocytosis of M. luteus, I screened 39 candidate genes by RNA interference-mediated knock down in S2 cells. A longstanding question was whether Eater recognizes live, naïve bacteria. I found that Eater-Fc bound equally well to naïve or heat-inactivated S. aureus or E. faecalis, suggesting that in vivo Eater directly targets live Gram-positive bacteria, enabling their phagocytic clearance and destruction. By contrast, Eater-Fc was unable to interact with live Gram-negative bacteria (E. coli, S. marcescens and P. aeruginosa). Eater binding required prior membrane-disrupting treatments. Cecropin A, a prototypic cationic, membrane-disrupting antimicrobial peptide could promote Eater-Fc binding to live E. coli, even at sublethal concentrations. These results suggest a previously unrecognized mechanism by which antimicrobial peptides cooperate with phagocytic receptors.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Drosophila melanogaster hat sich zu einem nützlichen Modellsystem zur Erforschung angeborener Abwehrmechanismen entwickelt. Insekten besitzen ein vielseitiges Immunsystem welches unter anderem antimikrobielle Peptide und Phagozyten umfasst. In Drosophila wird Phagozytose von sog. Plasmatozyten durchgeführt, einem Blutzelltyp, der den Makrophagen und neutrophilen Granulozyten des Menschen ähnelt. Der ‚Scavenger Rezeptor’ Eater wird von Plasmatozyten in Larven und adulten Insekten ausgeprägt. Er erkennt ein breites Spektrum bakterieller Pathogene und seine Ausprägung ist erforderlich für das Überleben von Infektionen mit Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien. Die bakteriellen Liganden und die Mechanismen, mit denen Eater diese verschiedenen Bakterien erkennt, sind unzureichend verstanden. Um diese Fragen zu erforschen, habe ich eine lösliche Rezeptorvariante hergestellt, Eater-Fc, welche aus den N-terminalen 199 Aminosäuren von Eater (4 EGF-ähnliche Wiederholungen umfassend) und einem C-terminalen Antikörper-Fc-Teil besteht. Zudem habe ich Antikörper gegen Eater-Fc hergestellt. Mit diesen Reagenzien konnte ich zeigen, dass Eater (i) auf der Oberfläche von Makrophagen-ähnlichen Drosophila S2 Zellen ausgeprägt wird, (ii) mit einem breiten, jedoch differenzierten Spektrum inaktivierter Mikroben interagiert, und (iii) an Peptidoglykan von Gram-negativen Proteobakterien (E. coli) und Gram-positiven Firmicutes (S. aureus, E. faecalis), jedoch nicht von Gram-positiven Actinobakterien (M. luteus), bindet. Um Gene zu finden, die an der Phagozytose von M. luteus beteiligt sind, habe ich S2 Zellen untersucht, in denen 39 Kandidaten-Gene mit Hilfe von RNA-Interferenz ausgeschaltet wurden. Eine bisher ungeklärte Frage war, ob Eater auch vermag, an lebende, unbehandelte Bakterien zu binden. Einerseits konnte ich zeigen, dass Eater-Fc lebende Gram-positive Firmicutes-Bakterien (S.aureus oder E. faecalis) bindet. Es liegt deshalb nahe zu vermuten, dass Eater diese Gram-positive Bakterien in vivo direkt erkennen und ihre Phagozytose und Zerstörung einleiten kann. Andererseits war Eater-Fc nicht in der Lage, mit lebenden Gram-negativen Proteobakterien (E. coli, S. marcescens und P. aeruginosa) zu reagieren. Um eine Bindung zu ermöglichen, mussten die Bakterien zuvor einer membran-schädigenden Behandlung unterzogen werden. Cecropin A, ein kationisches, membran-permeabilisierendes Peptid bewirkte, dass Eater an lebende E. coli binden konnte, sogar unter sublethalen Bedingungen. Meine Ergebnisse weisen somit auf einen bisher unbekannten Mechanismus hin, der es Antimikrobielle Peptiden ermöglicht, mit Phagozytose-Rezeptoren zu kooperieren. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Chung, Yoon-Suk Alexander alex-y-s-c@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-42928
Date:	5 July 2011
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Innate immunity English Phagocytosis English Drosophila English Pattern Recognition Receptor English
Date of oral exam:	4 July 2011
Referee:	Name Academic Title Pasparakis, Manolis Prof. Dr. Roth, Siegfried Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4292