Universität zu Köln

Plume, Nadine (2011). Molekulare Mechanismen isolierter und Syndrom-assoziierter Lipidstoffwechselstörungen. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Metabolische Erkrankungen sind ein Hauptfaktor für die Entstehung von Atherosklerose und das damit einhergehende Risiko für das Auftreten von akuten Myokardinfarkten. Sie stellen somit einen der wichtigsten Faktoren für die erhöhte Morbidität und Mortalität in der westlichen Population dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten neue genetische Faktoren und molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zu einer Hypercholesterinämie sowie zwei ausgewählten, angeborenen Syndromen führen, die bekanntermaßen mit metabolischen Störungen assoziiert sind. Wir initiierten molekulargenetische Untersuchungen bei 200 Patienten der deutschen LIANCO Kohorte mit diagnostizierter Hypercholesterinämie. Die Bestimmung des Mutationsspektrums in den bekannten Genen für familiäre Hypercholesterinämie (FH) führte zur Identifizierung von insgesamt 30 unterschiedlichen, heterozygoten LDLR-Mutationen bei 20 % der Patienten und zeigt die hohe Prävalenz von LDLR-Mutationen in Patientenkohorten ohne beschriebene positive Familienanamnese für Hypercholesterinämie. Die europäische APOB-Gründermutation p.R3500Q konnte nur bei einem Patienten detektiert werden. In PCSK9 wurde keine Mutation gefunden. Bei etwa 50 % der nachgewiesenen LDLR-Mutationen handelte es sich um Missense-Mutationen, die anderen 50 % umfassten Nonsense-Mutationen, Spleißmutationen, kleinere Deletionen und Duplikationen sowie größere Deletionen, die mittels MLPA detektiert wurden. Untersuchungen möglicher modifizierender genetischer Faktoren der Cholesterin-Konzentration bei Patienten mit LDLR Mutation, zeigten keine statistisch signifikanten Ergebnisse für eine Assoziation von Nonsense-SNPs in ABCA10, APOL3 und LPL. Bei einem Patienten konnten wir die heterozygote Nukleotidsubstitution c.-188C>T in der konservierten, GC-reichen SP1-Bindungsstelle im repeat 1 der LDLR-Promotorregion identifizieren. Ein Luciferase Reporter Assay zeigte, dass es infolge einer verminderten SP1-Bindungsfähigkeit an den Promotor in vitro zu einer signifikanten Reduktion der transkriptionellen Aktivität des mutanten Promotors um 80 % kommt. Diese Ergebnisse wiesen auf die große Bedeutung von transkriptionellen Veränderungen der LDLR-Expression in der Pathogenese der Hypercholesterinämie hin. Basierend auf dieser Erkenntnis führten wir bei Mutations-negativen Patienten der LIANCO Kohorte Mutationsanalysen in SREBP1 und SREBP2 durch, zwei Transkriptionsfaktoren, die eine zentrale Rolle in der Cholesterinhomöostase spielen, indem sie unter anderem die Regulation der LDLR-Expression kontrollieren. Wir konnten bei einem Patienten die heterozygote Missense-Mutation p.R812Q im SREBP1-Gen identifizieren und bei einem zweiten Patienten die heterozygote Missense-Mutation p.G852R in SREBP2. Nach genetischer Bestätigung der kausalen Rolle dieser Mutationen konnten wir mittels einer in vitro-Interaktionsstudie zeigen, dass beide Mutationen die konstitutive Wechselwirkung zwischen der regulatorischen, C-terminalen Domäne der SREBP-Vorläuferproteine und der cytoplasmatischen WD-Domäne von SCAP in der Membran des endoplasmatischen Retikulums beeinträchtigen. Infolgedessen kommt es zu einer verminderten Freisetzung des N-terminalen, transkriptionell aktiven Teils von SREBPs und dadurch zu einer reduzierten Expression von LDLR, was mittels Luciferase Reporter Assay nachgewiesen wurde. Die resultierende LDL-Rezeptordefizienz an der Zelloberfläche bietet eine Erklärung für die Akkumulation von LDL-Partikeln im Plasma der Patienten, die Diagnose Hypercholesterinämie und identifiziert zwei neue ursächliche Gene für Hypercholesterinämie. Mittels eines zweiten Ansatzes, bei dem große Familien mit diagnostizierter FH für Kopplungsanalysen verwendet wurden, ließen sich keine neuen FH-Gene identifizieren. In einer großen türkischen Familie mit neun betroffenen Individuen stellten wir fest, das das Auftreten von Phänokopien bei häufigen Erkrankungen die experimentellen Daten sehr beeinflussen kann und konnten zeigen, wie sich das Problem durch die Verwendung einer nicht Modell-basierten, nicht-parametrischen Kopplungsanalyse bewältigen lässt. Nachfolgend wurde die p.C222R LDLR-Mutation bei sieben von neun betroffenen Familienmitgliedern gefunden. Die Identifizierung von neuen genetischen Faktoren und molekularen Mechanismen der Hypercholesterinämie bei Patienten der LIANCO Kohorte kann entscheidend dazu beitragen, künftig eine präzisere genetische Beratung anzubieten, individuelle Risikoabschätzungen zu treffen und hoffentlich neue therapeutische Strategien zu entwickeln. Des Weiteren führten Studien über zwei angeborene, autosomal-rezessiv vererbte Syndrome, die mit metabolischen Störungen assoziiert sind, zur Identifizierung von neuen krankheitsverursachenden Mutationen und zur Aufklärung der molekularen Pathogenese dieser Erkrankungen. Nach genomweiter Kopplungsanalyse in einer Familie, die klinisch durch Hypogonadismus, Diabetes, Alopezie und mentale Retardierung charakterisiert ist, fanden wir eine krankheitsverursachende Mutation, c.1091+1G>A, im C2orf37-Gen, welches in einer großen homozygoten Region auf Chromosom 2q31.1 lokalisiert war. Während unserer Analysen wurde C2orf37 als kausales Gen für das autosomal-rezessive Woodhouse-Sakati Syndrom beschrieben, das überlappende Symptome mit unseren Familien aufweist. Zusätzlich identifizierten wir loss-of-function Mutationen in C2orf37 in zwei weiteren Familien mit diagnostizierten Syndromen, die überlappende Phänotypen zeigen, was die Vermutung nahelegte, dass diese zum Spektrum von Woodhouse-Sakati-ähnlichen Phänotypen gehören. Modifizierende genetische Faktoren sind vermutlich verantwortlich für die inter- und intrafamiliäre klinische Variabilität. Letztendlich ist es im Rahmen dieser Arbeit gelungen, mittels Exom-Sequenzierung, einer neuen High-End-Technologie, bei einem Patienten mit diagnostiziertem Wiedemann-Rautenstrauch Syndrom (WRS) die kausale homozygote Missense-Mutation p.G206R im PYCR1-Gen zu identifizieren. WRS ist ein seltenes, rezessives, neonatales Progerie Syndrom mit frühzeitig auftretenden endokrinen und metabolischen Störungen. Aufgrund der rezessiven Vererbung und der elterlichen Konsanguinität erwies es sich als äußerst effizient, die gewonnenen Exom-Daten mittels Analyse auf homozygote Bereiche zu filtern und so die Anzahl der detektierten potentiell pathogenen Varianten zu minimieren. PYCR1-Mutationen wurden bereits für ein Spektrum an Erkrankungen beschrieben, zu dem die Gerodermia Osteodysplastika, das Wrinkly Skin Syndrom und das de Barsy Syndrom gehören. Die klinische Re-Evaluierung unseres Patienten ergab Überlappungen mit diesen Erkrankungen und zeigte, dass der Phänotyp unseres Patienten eine schwere Form am Ende des Spektrums darstellt. Die gestörte PYCR1-Funktion beeinflusst den Prolin-Metabolismus und könnte sowohl die mitochondriale Funktion als auch die Produktionsmenge von freien Radikalen beeinträchtigen. Der pathogene Mechanismus muss in Zukunft zwar erst noch aufgeklärt werden, eine mitochondriale Fehlfunktion liefert jedoch bereits jetzt eine höchst schlüssige Arbeitshypothese für die bei unserem Patienten beobachtete beschleunigte Alterung und die aufgetretenen endokrinen und metabolischen Störungen.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Metabolic diseases are a main risk factor for the development of atherosclerosis and, subsequently, acute myocardial infarctions, thereby representing one of the most important factors for increased morbidity and mortality in Western populations. The present thesis was aimed at identifying novel genetic factors and molecular mechanisms involved in the development of hypercholesterolemia as well as genetic factors underlying two selected congenital syndromes associated with metabolic disorders. We initiated a molecular study of 200 patients of the German LIANCO cohort diagnosed with hypercholesterolemia. Determination of the spectrum of mutations in known genes for familial hypercholesterolemia (FH) revealed a total of 30 different heterozygous LDLR mutations in 20 % of the patients and thus clearly indicated a high prevalence of LDLR mutations also in patient cohorts without a family history of hypercholesterolemia. The European APOB founder mutation p.R3500Q could only be detected in a single patient and no mutation was found in PSCK9. About 50 % of the identified LDLR mutations were missense mutations and another 50 % comprised nonsense and splice alterations as well as small deletions and duplications and also larger deletions detected by MLPA. We tested for genetic modifiers of cholesterol levels, but could not obtain any statistically significant results for an association of nonsense SNPs in ABCA10, APOL3 and LPL in LDLR mutation-positive patients. In one patient, we identified the heterozygous nucleotide substitution c.-188C>T in the highly conserved, GC-rich SP1 binding domain in repeat 1 within the LDLR promoter region. As clearly demonstrated by a luciferase reporter assay, the decreased SP1 binding ability resulted in a significant reduction in transcriptional activity by 80 % of the mutant promoter in vitro. These results showed the importance of transcriptional alteration of LDLR expression in the pathogenesis of hypercholesterolemia. Based on this finding, we tested mutation-negative patients of the LIANCO cohort for mutations in SREBP1 and SREBP2, two transcription factors that play a central role in cholesterol homeostasis by, among other functions, controlling LDLR expression. We found the heterozygous missense mutation p.R812Q in the SREBP1 gene in one patient and the heterozygous missense mutation p.G852R in SREBP2 in a second patient. After genetic validation of their causative roles, we were able to demonstrate by in vitro interaction studies that both mutations affect the constitutive interplay between the regulatory C-terminal domain of the SREBP precursor proteins and the cytoplasmatic WD domain of SCAP in the membrane of the endoplasmatic reticulum. Consequently, the release of the N-terminal, transcriptionally active part of SREBPs is reduced, leading to a decreased expression of LDLR, which was confirmed by luciferase reporter assays. The resulting LDL receptor deficiency on the cell surface thus explains the accumulation of LDL particles in the plasma of the patients, the diagnosis of hypercholesterolemia, and identifies two novel genes causing hypercholesterolemia. A second approach using large families with FH for linkage analysis could not identify any novel FH genes. In our analysis of a large Turkish family with nine affected individuals we learned how the occurrence of phenocopies of a common disease can influence experimental data and how this problem may be overcome by the use of non-model based, non-parametric linkage analysis. Subsequently, the p.C222R LDLR mutation was identified in seven of nine affected family members. Our findings of novel genetic and molecular mechanisms of hypercholesterolemia in the patients of the LIANCO cohort will be helpful in the future to offer more accurate genetic counseling, to establish individual risk profiles and, hopefully, to develop new therapeutic strategies. Moreover, also the studies on two congenital, autosomal recessively inherited syndromes associated with metabolic diseases could successfully identify novel disease-causing mutations and elucidate the molecular pathogenesis of these disorders. After genome-wide linkage analysis in one family clinically characterized by hypogonadism, diabetes, alopecia, and mental retardation, we found a disease-causing mutation, c.1091+1G>A, in the C2orf37 gene, located within a large homozygous stretch on chromosome 2q31.1. C2orf37 had been described during our analysis as a causative gene for autosomal recessive Woodhouse-Sakati syndrome, which shows overlapping symptoms with our families. Additionally, we identified loss-of-function mutations in C2orf37 in two further families diagnosed with syndromes showing an overlapping phenotype, therefore considered to belong to the spectrum of Woodhouse-Sakati-like phenotypes. Modifying genetic factors are supposed to be responsible for the observed inter- and intrafamilial clinical variability. Finally, using whole-exome sequencing, a novel and high-end technology, we were able to identify the causative homozygous missense mutation p.G206R in the PYCR1 gene in a patient diagnosed with Wiedemann-Rautenstrauch syndrome (WRS). WRS is a rare recessive, neonatal progeria syndrome with premature appearance of endocrine and metabolic deficiencies. Recessive inheritance and parental consanguinity allowed us to analyze the obtained exome data with increased efficiency by filtering only for variants in homozygous chromosomal regions and therefore considerably minimizing the number of potentially pathogenic false variants. PYCR1 mutations have already been described for a spectrum of disorders which includes gerodermia osteodyplastica, wrinkly skin syndrome, and de Barsy syndrome. Clinical re-evaluation of our patient indicated some overlapping features with this spectrum of disorders and showed that the phenotype in our patient belongs to the severe end of this spectrum. Disturbed PYCR1 function influences prolin metabolism and might affect mitochondrial function as well as levels of free radical production. The pathogenic mechanism needs to be elucidated in the future, but mitochondrial dysfunction represents a highly relevant working hypothesis underlying accelerated ageing and the occurrence of endocrine and metabolic diseases as seen in our patient. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Plume, Nadine nadineplume@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-43283
Date:	May 2011
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Ehemalige Fakultäten, Institute, Seminare > Faculty of Mathematics and Natural Sciences > no entry
Subjects:	Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Metabolische Erkrankungen; Atherosklerose; Myokardinfarkt; Familiäre Hypercholesterinämie; Mutationsspektrum; LDLR; PCSK9; ApoB; LDLR-Promotormutation; Luciferase Reporter Assay; SREBP1; SREBP2; Transkriptionsfaktoren; Regulation LDLR-Expression; in vitro Interaktionsstudie; Kopplungsanalyse; Phänokopien; neue FH-GeneM; Woodhouse-Sakati Syndrom; C2orf37; modifizierende genetische Faktoren; Exom-Sequenzierung; Next Generation Sequencing; Wiedemann-Rautenstrauch Syndrom; Progerie; PYCR1; Prolin-Metabolismus German
Date of oral exam:	26 May 2011
Referee:	Name Academic Title Nürnberg, Peter Prof. Dr. Schmutzler, Rita Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4328