Universität zu Köln

Gupta, Manoj Kumar (2011). Mechanisms involved in regulation of MHC class I molecules in murine embryonic stem cells. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Major histocompatibility complex (MHC) is at the center of immune responses that support survival, fitness and adaptation of mammalian species to the environment. These molecules are not only crucial for adaptive and innate immune responses against microorganisms and cancer cells but also play an important role in reproduction process and development of embryo during the preimplantation period. In the present study, we use murine embryonic stem cells (ESCs) as model to dissect the molecular mechanism involved in the regulation of MHC class I molecules during differentiation in vitro. MHC class I molecules are expressed at very low levels on murine ESCs and they are not induced by the immunomodulatory cytokine interferon gamma (IFN) despite the presence of IFN receptors on their cell surface. First, we showed that removal of leukemia inhibitory factor (LIF), a standard component of murine ES cell culture media required for the maintenance of a pluripotent state, did not result in up regulation of MHC class I expression in murine ESCs, presumably due to incomplete inactivation under these experimental conditions of STAT3 signaling pathway, which is used by LIF. However, the addition of LIF to differentiated cells in embryoid bodies strongly suppressed the expression of these molecules. Down regulation of STAT3 in undifferentiated ESCs cultured in the presence of LIF significantly increased the expression of MHC class I molecules and this was further enhanced by IFN treatment. Flow cytometric analysis revealed that STAT1 is phosphorylated by IFN in STAT3 knockdown (KD) ESCs, whereas there was only weak or no phophorylation detected in mock siRNA 647-treated ESCs exposed to IFN. Luciferase reporter assay also indicated that GAS promoter responded to IFN much strongly in STAT3-depleted ESCs than in intact cells, suggesting that ESCs do not respond to IFN at least partially due to inhibitory effects of STAT3-signaling components on STAT1-phosphorylation. Moreover, the down regulation of suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) in STAT3 KD ESCs increases the possible regulation of STAT1 phosphorylation by SOCS3. No effect in MHC class I molecules induction was observed in STAT3 KD ES-derived cardiomyocytes (ESCMs) indicating the differential regulation of these molecules during the course of differentiation from undifferentiated stage (ESCs) to differentiated stage (ESCMs). An additional mechanism by which STAT3 regulates MHC class I expression may involve epigenetic modification of MHC class I gene expression since Dnmt knockout (KO) murine ESCs showed upregulation of MHC class I molecules. Chromatin modifying gene Eed1 but not Dnmt1 and Jmjd1 was significantly downregulated in STAT3 KD murine ESCs. Additionally, murine ESCs showed increased MHC class I expression and enhanced response to IFN after treatment with the DNA-methyltransferase inhibitor 2,5-azacytidine and histone deacetylase inhibitor Trichostatin A. Modulation of MHC class I expression by STAT3 KD in ESCs reduced their lysis by activated syngeneic NK cells and increased their lysis by cytotoxic T cells compared to mock siRNA 647-treated ESCs. These data indicate that STAT3 pathway plays a dual role in modulating the MHC class I expression in ESCs. Interfering with the inhibitory pathways that suppress MHC class I expression in pluripotent ESCs may help to control teratoma formation from contaminating ESCs in therapeutic cell transplants and may also help to eradicate cancer cells and virus-infected cells that are known to frequently evade immune recognition by down regulating the MHC class I expression.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) ist der Mittelpunkt der Immunantwort, welche Überleben, Fitness und Anpassung der Säugetiere an die Umgebung gewährleistet. Die MHC Moleküle sind nicht nur für die adaptive und die angeborene Immunantwort verantwortlich, sondern spielen außerdem eine wichtige Rolle im Reproduktionsprozess und der Entwicklung des Embryos während der Präimplantationsphase. In der vorliegenden Arbeit nutzen wir murinen embryonale Stammzellen (mESCs), um die molekularen Mechanismen, die an der Regulation der MHC Klasse I Moleküle während der in vitro Differenzierung der Stammzellen beteiligt sind, zu untersuchen. MHC Klasse I Moleküle werden in murinen ESCs nur schwach exprimiert und werden trotz entsprechender Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche nicht vom immunmodulatorischen Zytokin Interferon Gamma (IFN) induziert. Zunächst zeigten wir, das in Abwesenheit vom Leukemia inhibierenden Faktor (LIF), welcher als Standardmediumkomponente muriner ESC Kultur zur Erhaltung der Pluripotenz eingesetzt wird, nicht zur Hochregulierung der MHC Klasse I Molekülexpression führte. Dieser Umstand könnte auf eine unvollständige Inaktivierung des STAT3 Signalweges, über welchen LIF reguliert, unter den verwendeten experimentellen Konditionen zu erklären sein. Allerdings führte die Zugabe von LIF zu differenzierenden embryonalen Körpern (EB) zu einer starken Unterdrückung der MHC-Moleküle. Abregulierung von STAT3 in undifferenzierten ESCs, welche in Anwesenheit von LIF kultiviert wurden, erhöhten ihre MHC Klasse I Molekülexpression signifikant. IFN-Behandlung verstärkte diese Expression. Mittels Durchflusszytometrie konnte gezeigt werden, dass STAT1 in ESCs von IFN phosphoryliert wird, wenn STAT3 in der Zelle ausgeschaltet wird. Im Gegensatz dazu war nur eine schwache bis keine Phosphorylierung in ESCs unter IFN-Einfluss detektierbar, welche mit Kontroll-siRNA-647 behandelt wurden. Der Luziferasetest ergab ebenfalls, dass der GAS promotor in Zellen ohne STAT3-Expression weitaus stärker auf IFN reagierte, als in Zellen mit STAT3-Expression. Diese Daten lassen darauf schließen, dass ein Grund, warum ESCs nicht auf IFN reagieren, auf inhibierende Effekte von Komponenten aus dem STAT3-Signalweg auf die STAT1-Phosphorylierung zurückzuführen sind. Darüberhinaus führte die Abregulierung des Unterdrückerzytokinsignal 3 (SOC3) in STAT3-defizienten ESCs zu einem Anstieg der möglichen Regulation der STAT1-Phosphorylierung durch SOCS3. In STAT3-defizienten Kardiomyozyten, welche aus ESCs generiert wurden (ESCMs), war keine Induktion der MHC Klasse I Moleküle zu beobachten. Dies weist auf eine verschiedene Regulierung dieser Moleküle vom undifferenzierten zum differenzierten Zustand hin. Der Mechanismus durch den STAT3 direkt auf die MHC Klasse I Expression wirkt mag auch epigenetische Modifikationen mit einschließen, da murine DNMT Knockout (KO) ESCs ebenfalls eine Hochregulierte MHC Klasse I Expression zeigten. In STAT3 KD murinen ESCs wurde das Gen Eed1 signifikant herabreguliert, während die Expreession von Dnmt1 und Jmjd1 nicht signifikant verändert wurde. Außerdem zeigten murine ESCs erhöhte MHC Klasse I Expression und eine verstärkte Antwort auf IFN nach Behandlung mit dem DNA-methyltransferase Inhibitor 2,5-azacytidine und dem Histondeacetylase Inhibitor Trichostatin A. Im Vergleich zu mock siRNA 647-treated ESCs wurden STAT3 KD ESCs auch weniger effizient von aktivierten sygenen NK Zellen und effizienter von zytotoxischen T-Zellen lysiert. Diese Daten weisen darauf hin, dass STAT3 eine duale Rolle bei der Modulation der MHC Klasse I Expression in ESCs spielt. Die Auseinandersetzung mit den inhibierenden Signalwegen, welche die MHC Klasse I Molekülexpression in ESCs unterdrücken, kann hilfreich sein bei der Kontrolle von Tumorbildung durch kontaminierende ESCs in therapeutischen Zelltransplantationen, sowie bei der Vernichtung von Krebs- und virusinfizierten Zellen, die bekannt dafür sind der Immunerkennung durch Abregulierung der MHC Klasse I Moleküle zu entkommen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Gupta, Manoj Kumar mkgupta80@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-44089
Date:	5 September 2011
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Zoologisches Institut
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Embryonic stem cells, MHC class I, Interferon-gamma English
Date of oral exam:	18 October 2011
Referee:	Name Academic Title Plickert, Guenter Prof. Dr. Schwarz, Guenter Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4408