Universität zu Köln

Zurek, Birte Helene (2011). TRIM27 negatively regulates NOD2 by ubiquitination and proteasomal degradation. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing gene (NLR) family member NOD2 is involved in mediating antimicrobial innate immune responses. Uncontrolled NOD2 activity can lead to severe inflammatory disorders, but the regulation of NOD2 is still poorly understood. The NOD2 ATPase domain seems to exhibit a crucial regulatory function. Mutations affecting conserved residues of this domain are linked to the auto-inflammatory diseases Blau syndrome and early-onset sarcoidosis, whereas mutation of the Walker A box lead to signalling repression. Conserved amino acids within the ATPase domain of NOD2 and the related NLR protein NOD1 were analysed in a systematic mutational approach. The results revealed that a functional Walker A and B box, GxP motif and Sensor 1 are important for both NOD1 and NOD2 activation, as mutation of these residues strongly impaired NF-κB activation. This indicates that nucleotide binding and an initial nucleotide hydrolysis step are essential for both NOD1 and NOD2 activation. Furthermore, the data gave evidence that mutations in the extended Walker B box and the WH histidine have opposing effects on NOD1- and NOD2-mediated signalling. Whereas they were non-functional in NOD1, NOD2 auto-activation was enhanced compared to the wild type. This led us to propose that NOD2 is more prone for auto-activation and need to be more tightly controlled than NOD1. In line with this assumption, NOD2, but not NOD1, was found to be subjected to rapid protein turnover involving ubiquitin-mediated proteasomal degradation. A yeast two-hybrid screen identified TRIM27 as a new binding partner for NOD2. The specificity of this interaction was confirmed by reciprocal co-immunoprecipitation experiments in a human cell line. The interaction was mediated by the NOD2 nucleotide-binding domain (NBD) and the TRIM27 PRY-SPRY motif. TRIM27 is a RING domain E3 ubiquitin ligase. NOD2, but not NOD1, was identified to be ubiquitinated with K48-linked ubiquitin chains and subjected to proteasomal degradation dependent on functional TRIM27. Accordingly, TRIM27 negatively affected NOD2-mediated pro-inflammatory responses. The NOD2-TRIM27 interaction was enhanced upon stimulation with the NOD2 agonist MDP. This suggests that TRIM27 is involved in a negative feed-back loop to control NOD2-mediated signalling. Of note, TRIM27 is a nuclear protein in most human cells. This study demonstrated that also NOD2 can shuttle to the nucleus and co-localizes with TRIM27. NOD2 loss-of-function mutations are associated with Crohn’s disease. Analysis of colonic biopsies from Crohn’s disease patients revealed significantly enhanced TRIM27 mRNA expression, underscoring a physiological role of TRIM27 in regulating NOD2 signalling. We conclude that TRIM27 negatively regulates NOD2-mediated signalling by destabilization of NOD2 and suggest that TRIM27 could be a new and promising target for therapeutically intervention in NOD2-associated diseases.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language NOD2 ist ein Mitglied der NLR-Proteinfamilie und an der Entwicklung angeborener Immunantworten beteiligt. Unkontrollierte NOD2-Aktivität kann zu schweren entzündlichen Krankheiten führen, allerdings ist bislang noch nicht ausreichend bekannt, wie NOD2 reguliert wird. Die ATPase Domäne in NOD2 besitzt eine wichtige regulatorische Funktion. Mutationen von konservierten Aminosäuren in dieser Domäne sind mit Autoimmunerkrankungen wie dem Blau-Syndrom und der early onset Sarkoidose verbunden, aber auch mit der Inhibierung des NOD2-Signalweges wie z.B. bei einer Mutation der Walker A Box. In einer systematischen Mutationsanalyse wurden konservierte Aminosäuren der ATPase Domäne von NOD2 und des verwandten Proteins NOD1 untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass für die Aktivierung von NOD1 und NOD2 sowohl eine funktionelle Walker A und B Box als auch das GxP-Motiv und der Sensor 1 wichtig sind, da Mutationen von diesen die NF-κB-Aktivierung stark beeinträchtigten. Dies weist darauf hin, dass eine Nukleotid-Bindung und ein initialer Nukleotid-Hydrolyseschritt für die Aktivierung von NOD1 und NOD2 notwendig sind. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Mutationen der erweiterten Walker B Box sowie des konservierten Histidin in der WH-Domäne (winged helix) unterschiedliche Auswirkungen auf die NOD1- und NOD2-Aktivierung haben. Während sie in NOD1 nicht mehr funktionell sind, führen sie bei NOD2 zu einer erhöhten Autoaktivierung im Vergleich zum Wildtyp. Wir nehmen daher an, dass NOD2 leichter autoaktiviert werden kann und besser als NOD1 kontrolliert werden muss. In Übereinstimmung mit dieser Annahme wurde gezeigt, dass NOD2 aber nicht NOD1 einem schnelleren Proteinumsatz unterliegt, welcher durch Ubiquitin-vermittelten proteasomalen Abbau erfolgt. In einem Hefe-Zwei-Hybrid-Screen wurde TRIM27 als neuer Interaktionspartner von NOD2 identifiziert. Die Spezifität dieser Interaktion wurde durch reziproke Co-Immunoprezipitationsexperimente bestätigt. Die Interaktion erfolgt über die Nukleotid-bindende Domäne (NBD) von NOD2 und das TRIM27 PRY-SPRY-Motiv. TRIM27 ist eine RING-Domänen E3 Ubiquitin Ligase. Es wurde gezeigt, dass NOD2 – nicht jedoch NOD1 – abhängig von funktionellem TRIM27 mit K48-verlinkten Ubiquitinketten modifiziert wird, was wiederum zur proteasomalen Degradation von NOD2 führt. Dementsprechend negativ beeinflusste TRIM27 die NOD2-vermittelten pro-inflammatorischen Immunantworten. Die NOD2-TRIM27-Interaktion wurde durch die Stimulation mit dem NOD2-Agonisten MDP verstärkt. Dies deutet darauf hin, dass TRIM27 in einen negativen Feedback-Loop der den NOD2-Signalweg kontrolliert, involviert ist. In humanen Zellen ist TRIM27 hauptsächlich im Zellkern lokalisiert. Es wurde gezeigt, dass auch NOD2 in den Zellkern transportiert werden kann und dort mit TRIM27 co-lokalisiert. NOD2-Mutationen, die zu einem Funktionsverlust von NOD2 führen, sind mit Morbus Crohn assoziiert. Kolonbiopsien von Morbus Crohn-Patienten zeigten eine signifikant erhöhte Expression von TRIM27 mRNA, was die physiologische Rolle von TRIM27 bei der NOD2-Regulation verdeutlicht. Aus diesen Daten kann geschlossen werden, dass TRIM27 NOD2-vermittelte Immunreaktionen durch eine Destabilisierung von NOD2 negativ reguliert. TRIM27 könnte daher ein neuer, vielversprechender Angriffspunkt für therapeutische Maßnahmen bei NOD2-assoziierten Krankheiten sein. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Zurek, Birte Helene birte.zurek@arcor.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-44571
Date:	December 2011
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language NLR English TRIM27 English innate immunity English ubiquitination English E3 ligase English
Date of oral exam:	18 October 2011
Referee:	Name Academic Title Howard, Jonathan Prof. Dr. Paulsson, Mats Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4457