Universität zu Köln

Laurien, Lucie Henriette (2021). The role of RIPK1 auto-phosphorylation at S166 in cell death and inflammatory signaling. PhD thesis, Universität zu Köln.

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• The role of RIPK1 auto-phosphorylation at S166 in cell death and inflammatory signaling. (deposited 06 May 2021 12:07) [Currently Displayed]

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Abstract

Receptor-Interacting Protein Kinase 1 (RIPK1) functions as a key player downstream of innate immune receptors such as Tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1) and Toll-like receptors(TLRs). In these signaling pathways, RIPK1 promotes cell survival and tissue homeostasis in a manner independent of its catalytic function, whereas its kinase activity mediates cell death. Importantly, RIPK1 kinase activity has emerged as a driver of cell death and inflammation in mouse models and has been implicated in the pathogenesis of human inflammatory and degenerative diseases. RIPK1 auto-phosphorylates at multiple sites, including Serine (S) 14/15, S161, S166 and Threonine (T)169 and to date, auto-phosphorylation is believed to be the main function of its kinase activity. Whereas auto-phosphorylation at S166 is routinely used as a biomarker for RIPK1 activation, its functional importance and physiological relevance have not been investigated. In this work, we aimed to shed light on the role of RIPK1 autophosphorylation at S166 for RIPK1-mediated signaling. To this aim, we generated mice expressing RIPK1 with non-phosphorylatable serine to alanine mutation at position 166 from the endogenous Ripk1 locus (Ripk1S166A/S166A mice). We show that RIPK1S166A mutation does not impair the kinase activity-independent function of RIPK1 to induce pro-inflammatory and pro-survival signaling downstream of TNFR1, TLR 3 and 4. On the other hand, we observed a partial protection from TNFR1-induced, RIPK1 kinase activity-dependent apoptosis and necroptosis as well as from TLR 3- and 4-induced necroptosis in Ripk1S166A/S166A cells, showing that RIPK1 auto-phosphorylation at S166 drives its catalytic activity-dependent function to induce cell death. Strikingly, RIPK1S166A mutation completely protected mice from RIPK1 kinase activity-dependent inflammatory pathologies in the colon, liver and skin and decreased lethality in a model of systemic inflammation, showing that in vivo, RIPK1 auto-phosphorylation at S166 is essential to drive cell death and inflammation. Mechanistically, RIPK1S166A mutation inhibited the formation of cell death-inducing complexes downstream of TNFR1 as well as TLR 3 and 4, demonstrating that auto-phosphorylation at S166 enables engagement of RIPK1 in cytotoxic complexes. Furthermore, our data suggest that RIPK1 autophosphorylation at S166 acts as a driver of kinase activity and facilitates auto-phosphorylation at other sites. Taken together, the data presented in this thesis show that auto-phosphorylation at S166 licenses RIPK1 kinase activity to induce downstream signaling and promote cell death. Therefore, our results warrant the use of S166 phosphorylation as a marker for RIPK1 activation, which can aid in the stratification of human patients that may benefit from treatment with RIPK1 kinase inhibitors.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Receptor-Interacting Protein Kinase 1 (RIPK1) ist ein Schlüsselprotein in Signalwegen der angeborenen Immunantwort, die in Folge von Aktivierung verschiedener Rezeptoren wie Tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1) und Toll-like receptors (TLRs) ablaufen. In diesen Signalwegen fördert RIPK1 die Lebensfähigkeit von Zellen sowie Gewebshomöostase unabhängig von seiner Kinaseaktivität, wobei seine katalytische Aktivität Zelltod vermittelt. Von Bedeutung ist, dass sich die Kinaseaktivität von RIPK1 als Treiber von Zelltod und Entzündung in Mausmodellen herausgestellt hat und mit der Pathogenese von humanen entzündlichen und degenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht wird. RIPK1 autophosphoryliert an mehreren Aminosäureresten, zu denen Serin (S) 14/15, S161, S166 und Threonin (T)169 gehört und zur Zeit nimmt man an, dass Autophosphorylierung die hauptsächliche Funktion der Kinaseaktivität von RIPK1 ist. Obwohl Autophosphorylierung an Stelle 166 routinemäßig als Biomarker für RIPK1 Aktivierung eingesetzt wird, wurden die funktionelle Bedeutung und physiologische Relevanz dieser Position bisher nicht untersucht. Ziel dieser Arbeit war, die Rolle der RIPK1-Autophosphorylierung an S166 für die RIPK1- vermittelte Signalübertragung zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden Mäuse generiert, die RIPK1 mit nicht-phosphorylierbarer Serin zu Alanin Mutation an Position 166 vom endogenen Ripk1-Locus exprimieren (Ripk1S166A/S166A-Mäuse). Wir konnten zeigen, dass die RIPK1S166A-Mutation die Kinaseaktivitäts-unabhängige Funktion von RIPK1 nicht beeinträchtigt, um pro-entzündliche und überlebensfördernde Signale stromabwärts von TNFR1, TLR 3 und 4 zu induzieren. Andererseits beobachten wir eine teilweise Inhibierung der TNFR1-induzierten, RIPK1-Kinaseaktivitäts-abhängigen Apoptose und Nekroptose sowie der TLR 3- und 4-induzierte Nekroptose in Ripk1S166A/S166A-Zellen, was zeigt, dass die RIPK1- Autophosphorylierung an Position S166 die von der katalytischen Aktivität abhängige Funktion von RIPK1, Zelltod zu induzieren, steuert. Bemerkenswerterweise schützte die RIPK1S166AMutation Mäuse vollständig vor RIPK1 Kinaseaktivitäts-abhängigen entzündlichen Pathologien in Dickdarm, Leber und Haut und verringerte die Letalität in einem Modell systemischer Entzündung, was zeigt, dass in vivo die RIPK1-Autophosphorylierung an S166 essentiell ist, Zelltod und Entzündung zu fördern. In Bezug auf den zugrundeliegenden Mechanismus, beobachteten wir eine Inhibierung der Bildung von Zelltod-induzierenden Komplexen stromabwärts von TNFR1 sowie TLR 3 und 4 durch die RIPK1S166A-Mutation, was zeigt, dass die Autophosphorylierung an S166 die Einfügung von RIPK1 in zytotoxische Komplexe ermöglicht. Darüber hinaus legen unsere Ergebnisse nahe, dass die RIPK1- Autophosphorylierung an S166 als Treiber der Kinaseaktivität wirkt und die Autophosphorylierung an anderen Stellen erleichtert. Zusammengenommen zeigen die in dieser Arbeit präsentierten Daten, dass die Autophosphorylierung an S166 die RIPK1- Kinaseaktivität lizenziert die nachgeschaltete Signalübertragung zu induzieren und den Zelltod zu fördern. Daher rechtfertigen unsere Ergebnisse die Verwendung der S166- Phosphorylierung als Marker für die Aktivierung von RIPK1, was die Gliederung menschlicher Patienten unterstützen kann, die von einer Behandlung mit RIPK1-Kinase-Inhibitoren profitieren können. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Laurien, Lucie Henriette UNSPECIFIED UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-455820
Date:	12 April 2021
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	CECAD - Cluster of Excellence Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases
Subjects:	Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Receptor-Interacting Protein Kinase 1 (RIPK1) UNSPECIFIED auto-phosphorylation UNSPECIFIED inflammation UNSPECIFIED cell death UNSPECIFIED Serine 166 UNSPECIFIED
Date of oral exam:	8 March 2021
Referee:	Name Academic Title Pasparakis, Manolis Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/45582