Universität zu Köln

Meesters, Christian (2012). Functional analysis of small signaling molecules in jasmonate signaling. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Plants exhibit multitudes of defense mechanisms against different kinds of stress. Jasmonic acid (JA) is one of the identified signaling compounds mediating plant’s response to wounding, attack by herbivores or necrotrophic pathogens. Central parts of the JA signaling pathway have recently been unraveled by demonstrating that (+)-7-iso-JA-L-Ile is the most bioactive form of JA and that the SCF(COI1)-complex functions as its receptor. However, many other components of the JA signaling pathway remain unknown. This includes how and where protein kinases may be involved in JA signaling. Likewise, the mechanistic details of cross-talk between different hormone signaling pathways are unknown. Using a chemical biology approach, screening for selective compounds that can be used as tools in applications complementing genetic approaches, I aimed at identifying some of these unknown components. The advantage of this method is that it has the potential to circumvent redundancy of gene function, lethality of mutants and pleiotropic effects, problems generally encountered in genetic approaches. I developed a screening procedure for bioactive compounds that uses a transgenic Arabidopsis thaliana line, harboring the JA-responsive reporter gene LOX2p::LUC. This procedure allowed bidirectional screening for activators or inhibitors of reporter expression. Sifting through approx. 1,700 natural compounds, I identified one activator of reporter gene expression and 16 inhibitors of methyl jasmonate induced reporter expression. Critical validation of these primary hits revealed that the putative activator in fact interfered with the activity of the luciferase reporter. It presumably binds and stabilizes luciferase, thereby enhancing its apparent activity, whereas reporter gene expression was not affected. After validation and characterization of the inhibitors, one compound (12) was identified as selective inhibitor of JA signaling. Structure-activity relationship studies, using derivatives of the compound, defined parts of the molecule that where indispensable for its bioactivity. Based on this analysis, a derivatized probe was designed that harbors a ‘photoreactive’ benzophenone for establishing covalent binding and an alkyne residue to attach a detectable fluorophore using ‘click chemistry’. Importantly, this probe retained activity and was used in first affinity-based target identification experiments. In a second screen using a small, targeted library of 84 known protein kinase inhibitors, I identified three compounds that impaired JA signaling. This finding suggests the involvement of protein kinases in the JA signaling pathway that has been previously reported. Among the identified inhibitors was 5-iodotubercidin, a nucleoside antibiotic. A derivative of this compound, toyocamycin, was previously described to selectively impair auxin signaling, which is mechanistically related to JA signaling. Several structural analogs were investigated with respect to their effect on JA-dependent reporter expression or JA-independent readouts. Toyocamycin was considered to be the most specific derivative. To elucidate the role of toyocamycin in the Arabidopsis hormonal signaling network, I performed a microarray analysis after treatment with toyocamycin. The expression data showed that this compound modulates expression of JAZ genes, which are repressors of JA induced gene expression. Toyocamycin also modulated genes, which may be involved in hormonal crosstalk between e.g. auxin or salicylic acid signaling. The fact that toyocamycin caused a root growth phenotype, which is dependent on allene oxide synthase (AOS) and jasmonoyl-isoleucine synthetase (JAR1), indicated that multiple targets may exist, because inhibition of the LOX2 marker was independent of JAR1. Identification of the protein targets of toyocamycin and compound 12 may eventually lead to identification of yet unknown components in JA signaling or hormonal crosstalk.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Pflanzen weisen eine Reihe an Verteidigungsmechanismen gegen verschiedene Arten von Stress auf. Jasmonsäure (JA) ist eine der bekannten Signalkomponenten in der Pflanzenreaktion auf Verwundung, Herbivorenangriff oder auf necrotrophe Pathogene. Wesentliche Teile des JA Signalwegs sind bereits aufgedeckt. (+)-7-iso-JA-L-Ile ist die bioaktivste Form von JA und der SCF(COI1)-Komplex ist der Rezeptor. Andere Komponenten des JA Signalwegs sind noch unbekannt. Diese schließen ein, ob und wie Proteinkinasen involviert sind. Ebenso sind mechanistische Details des „Crosstalks“ zwischen verschiedenen Hormonsignalwegen unbekannt. Über einen „chemisch biologischen“ Ansatz – Durchmustern von Chemikalienbibliotheken nach selektiven chemischen Verbindungen, die in genetisch komplementierenden Versuchen als Werkzeug eingesetzt werden können – habe ich versucht, solche unbekannten Komponenten zu identifizieren. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die Möglichkeit, Genredundanz, Lethalität von Mutanten und pleiotrope Effekte zu umgehen, welche häufig auftretende Probleme in genetischen Ansätzen sind. Ich habe eine Screeningmethode entwickelt, die eine transgene Arabidopsis thaliana-Linie verwendet, welche den JA-induzierbaren Reporter LOX2p::LUC trägt. Dieser Ansatz erlaubte bidirektionales Durchmustern nach Aktivatoren oder Inhibitoren der Reporterexpression. Aus ca. 1700 Naturstoffverbindungen habe ich einen Aktivator von Reporterexpression und 16 Inhibitoren von Methyljasmonat-induzierter Reporterexpression identifiziert. Durch kritische Validierung dieser primären Kandidaten stellte sich heraus, dass der vermeintliche Aktivator die Aktivität des Luziferasereporters beeinflusste. Vermutlich bindet und stabilisiert die Verbindung Luziferase, wodurch scheinbar die Aktivität gesteigert wird, ohne jedoch Genexpression zu beeinflussen. Nach Validierung und Charakterisierung der Inhibitoren, habe ich Verbindung 12 als selektiven Inhibitor des JA Signalwegs bestätigt. Die Anwendung von Derivaten dieser Verbindung ergab definierte Struktur-Aktivitätsbeziehungen und zeigte für die Aktivität notwendige Strukturen auf. Darauf aufbauend wurde eine modifizierte Sonde entwickelt, die einen „photoaktivierbaren“ Benzophenonrest – zum Herstellen von kovalenten Bindungen mit Proteinen – und einen Alkinrest, zum Anfügen eines detektierbaren Fluorophores über „Klick-Chemie“, enthält. Diese Sonde wies weiterhin Bioaktivität auf und wurde in ersten affinitätsbasierten Experimenten angewandt, um mögliche Zielproteine zu identifizieren. In einem zweiten Screen mit einer kleinen zielgerichteten Chemikalienbibliothek, die aus 84 beschriebenen Proteinkinaseinhibitoren besteht, habe ich drei Proteinkinaseinhibitoren identifiziert, welche den JA Signalweg beeinflussten. Dies deutet auf eine Rolle von Proteinkinasen im JA Signalweg hin. Unter den identifizierten Inhibitoren war 5-Iodotubercidin, ein Nukleosidantibiotikum. Ein Derivat der Verbindung, Toyocamycin, wurde bereits als selektiver Inhibitor des Auxin Signalwegs beschrieben, welcher dem JA Signalweg mechanistisch sehr ähnelt. Mehrere Strukturanaloga wurden auf ihren Effekt auf jasmonatabhängige Reporterexpression oder jasmonatunabhängige Reaktionen untersucht. Toyocamycin schien diesbezüglich die spezifischste Verbindung zu sein. Um die Rolle von Toyocamycin im Arabidopsis Hormonnetzwerk zu erklären, habe ich den Effekt der Verbindung in einer Microarray-Analyse untersucht. Die Expressionsdaten zeigten, dass Toyocamycin die Expression von JAZ-Genen, Repressoren von JA-induzierter Genexpression, veränderte. Außerdem wurde Expression von Genen beeinflusst, die im „Hormoncrosstalk“ zwischen z. B. Auxin- oder Salicylsäure Signalwegen eine Rolle spielen könnten. Toyocamycin hemmt des Weiteren Wurzelwachstum, was abhängig von der Allenoxidsynthase (AOS) und von der Jasmonoylisoleucinsynthetase (JAR1) ist. Dies deutet auf die Existenz von mehreren Zielproteinen hin, denn die Hemmung des LOX2 -Markers war unabhängig von JAR1. Die Identifizierung von Zielproteinen von Toyocamycin und Verbindung 12 wird möglicherweise zur Identifizierung von bisher unbekannten Komponenten des JA Signalwegs oder „Hormoncrosstalk“ führen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Meesters, Christian meesters@mpipz.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-46570
Date:	2012
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Jasmonate; Chemical Genetics; Chemical Biology; Arabidopsis thaliana; Plant Defense English
Date of oral exam:	23 January 2012
Referee:	Name Academic Title Flügge, Ulf-Ingo Prof. Schulze-Lefert, Paul Prof. Wasternack, Claus Prof.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4657