Universität zu Köln

Bielig, Harald Frank (2012). Screening for components involved in NLR-mediated immune signalling. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Many Members of the intracellular nucleotide binding and oligomerisation domain(NOD)-like receptor (NLR) family have functions in the innate immune system. The NLR NOD1 acts as pattern recognition receptor and confers immune responses against a broad range of bacteria by triggering NF-kappaB and MAPK signalling cascades upon detection of bacterial peptidoglycan. This contributes to bacterial clearance, to the onset of a pro-inflammatory immune response and the release of anti-microbial peptides. As overwhelming inflammatory responses can be detrimental to the host, inflammatory signalling cascades have to be tightly controlled. Even though the main components of the NOD1 signalling cascade are identified,little is known about the regulation and fine-tuning so far. In this project, we identified novel components of the NOD1 signalling pathway by an auto-mated high-throughput siRNA screen using a cell based NF-kappaB reporter system in epithelial HEK293T cells. To this end,we screened the human druggable genome siRNA library for NOD1-mediated NF-kappaB activation upon stimulation with the elicitor Tri-DAP. Hits specifically involved in NOD1-mediated NF-kappaB activation were identified using TNF-α-stimulation as differential read-out. Finally, these hits were validated in myeloid THP1 cells. Beside the established NOD1 pathway component RIP2, the combined screening steps identified the BIRC family member XIAP as the strongest inhibiting hit. Follow-up experiments confirmed XIAP as an essential component of NOD1-mediated responses to the minimal NOD1 elicitor and to Shigella flexneri. We also revealed that XIAP contributes to responses mediated by the closely related NOD2 protein. In line with a recent report, we provide evidence that XIAP acts upstream of the IKK complex in the NOD1 signalling cascade. Strikingly, the screen revealed that the type II BMP receptor BMPR-2 is specifically involved in NOD1 signalling. Further experiments confirmed these findings and revealed that BMPR-2 positively regulates NOD1 signalling, likely by contributing to stabilisation of XIAP. Furthermore, we analysed the contributions of the BIRC proteins BIRC2 and BIRC3, which are closely related to XIAP, and of the other human BIRC proteins to NOD1-mediated responses. By using siRNA-mediated gene knock-down, we confirmed that BIRC2 positively regulates NOD1 signalling. Furthermore, we provide evidence that also BIRC5 and BIRC8, which have not been linked to innate immunity so far, positively contribute to NOD1-mediated inflammatory responses. Another event in NOD signalling that is still not fully understood is how bacterial peptidoglycan is translocated to the cytoplasm of host cells, as extracellular bacteria are known to activate NOD1 as well as NOD2. In the second part of this project, we analysed if bacterial outer-membrane vesicles (OMVs) might serve as carriers for peptidoglycan. We provide clear evidence that OMVs derived from the extracellular pathogen Vibrio cholerae are internalised by host cells, contain peptidoglycan and trigger NOD1- and NOD2-dependent inflammatory responses. OMVs derived from bacteria deficient for HapR, a master regulator of quorum sensing that represses the expression of virulence genes, induced markedly lower NOD-mediated inflammatory responses than OMVs derived from WT bacteria. In contrast, the overall peptidoglycan composition and the inflammatory potential of bacterial lysates derived from deltahapR compared to WT bacteria did not change. We conclude that V. cholerae uses quorum sensing to influence the pepdidoglycan content of OMVs, to prevent detection by the host innate immune system under virulent conditions.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Viele Mitglieder der intrazellulären Nukleotid-binde und oligomerisierungsdomäne (NOD) ähnlichen Rezeptor (NLR) Familie erfüllen Funktionen im angeborenen Immunsystem. Das NLR Protein NOD1 fungiert als Mustererkennungs-Rezeptor und vermittelt Immunantworten gegen ein breites Spektrum von Bakterien durch Erkennen von bakteriellem Peptidoglykan und anschließender Aktivierung von NF-kappaB und MAP-Kinase Signaltransduktionskaskaden. Dies trägt zur Beseitigung der Bakterien, zur Induktion einer entzündlichen Immunantwort sowie zur Expression von antimikrobiellen Peptiden bei. Da überbordende Immunantworten schädlich für den Wirt sein können, müssen derartige inflammatorische Signaltransduktionskaskaden strikt reguliert werden. Obwohl die Hauptkomponenten der NOD1 Signaltranduktionskaskade bekannt sind, ist wenig über die Regulation und die Feinabstimmung dieses Signalweges bekannt. In diesem Projekt haben wir mittels eines automatisierten Hochdurchsatz siRNA Screens unter Verwendung eines zellbasierten NF-kappaB Reportersystems in epithelialen HEK293T Zellen neue Komponenten des NOD1 Signalweges identifiziert. Zu diesem Zweck wurde eine humane „Druggable Genome“ siRNA Bibliothek im Hinblick auf NOD1-vermittelte NF-kappaB Aktivierung induziert durch den Elicitor Tri-DAP untersucht. Kandidaten, die spezifisch im NOD1 Signalweg eine Rolle spielen, wurden durch ein differentielles Auslesen mittels TNF-α-Stimulation identifiziert. Abschließend wurden diese Kandidaten in myeloiden THP1 Zellen bestätigt. Neben der Komponente RIP2, welche bekannt dafür ist, eine regulatorische Funktion im NOD1 Signalweg auszuüben, haben wir XIAP, ein Mitglied der BIRC Familie, als stärksten Kandidaten identifiziert. Anschließende Experimente konnten XIAP als essentielle Komponente für NOD1-vermittelte Antworten auf den minimalen NOD1-Elicitor sowie auf Shigella flexneri Infektion bestätigen. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass XIAP oberhalb des IKK Komplexes im NOD1 Signalweg agiert und dass XIAP auch in Immunantworten vermittelt durch das verwandte Protein NOD2 eine wichtige Rolle spielt. Interessanterweise hat der Screen auch gezeigt, dass der Typ II BMP Rezeptor BMPR-2 spezifisch in den NOD1 Signalweg involviert ist. Diese Hinweise wurden durch anschließende Experimente bestätigt: Es erscheint sehr wahrscheinlich, dass BMPR-2 eine positive regulatorische Funktion im NOD1 Signalweg ausübt, wahrscheinlich durch einen Beitrag zur Stabilisierung von XIAP. Darüber hinaus haben wir die Einflüsse der BIRC Proteine BIRC2 und BIRC3, welche eine enge Verwandtschaft zu XIAP aufweisen, sowie der anderen humanen BIRC Proteine auf NOD1-vermittelte Antworten untersucht. Durch siRNA-vermittelte Depletion konnten wir bestätigen, dass BIRC2 eine positive regulatorische Funktion auf NOD1-vermittelte Signalwege ausübt. Ausserdem liefern wir Hinweise dafür, dass auch BIRC5 und BIRC8, die bisher noch nicht mit angeborener Immunität in Verbindung gebracht wurden, zur Positivregulation von NOD1-vermittelten Antworten beitragen. Ein weiterer wichtiger Prozess in NOD-vermittelten Immunantworten, der bisher nicht vollständig verstanden ist, ist die Aufnahme von bakteriellem Peptidoglykan in Wirtszellen, da auch extrazelluläre Bakterien bekannt dafür sind, NOD1- sowie NOD2-vermittelte Immunantworten auszulösen. Im zweiten Teil dieses Projektes haben wir untersucht, ob bakterielle Vesikel der äußeren Membran („outer-membrane Vesicles“ (OMVs)) als Überträger von Peptidoglykan dienen können. Wir haben klare Hinweise dafür gefunden, dass OMVs, die aus dem extrazellulären Pathogen Vibrio cholerae gewonnen wurden, von Wirtszellen aufgenommen werden, Peptidoglykan enthalten sowie NOD1- und NOD2-vermittelte entzündliche Antworten auslösen. OMVs von V. cholerae Bakterien defizient für HapR, einen Hauptregulator des Quorum Sensings welcher die Expression von Virulenzgenen unterdrückt, hingegen lösten deutlich geringere NOD-vermittelte entzündliche Antworten aus als OMVs von Wildtyp Bakterien. Im Gegensatz dazu waren die gesammte Zusammensetzung des Peptidoglykans und das entzündliche Potential von bakteriellen Lysaten von deltahapR Bakterien im Vergelich zu Lysaten von Wildtyp Bakterien nicht verändert. Wir schließen daraus, dass Vibrio cholerae den Quorum Sensing Prozess verwendet, um den Peptidoglykangehalt von OMVs zu beeinflussen und damit einer Entdeckung durch das angeborene Immunsystem des Wirtes zu entgehen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Bielig, Harald Frank harald.bielig@hotmail.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Corporate Creators:	Uniklinik Köln
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-46599
Date:	2012
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Inflammation, Innate Immunity, Host Defence, NLR, NOD1, Signalling, NF-kappaB, siRNA, HT Screening English
Date of oral exam:	3 April 2012
Referee:	Name Academic Title Howard, Jonathan Prof. Dr. Paulsson, Mats Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4659