Universität zu Köln

Donovan, Catriona (2012). Cytoskeleton proteins involved in chromosome segregation and cell division in Corynebacterium glutamicum. PhD thesis, Universität zu Köln.

Preview

PDF Catriona_Donovan_Thesis.pdf Download (7MB)

Abstract

The chromosome partitioning system of the rod-shaped actinomycete, Corynebacterium glutamicum consists of the Walker-type ATPase (ParA), a DNA binding protein (ParB) and centromere-like parS sites, located at the origin-proximal region of the chromosome. ParB binds parS sites, specifically. ParA is recruited to the ParB-parS nucleoprotein complex, likely providing the driving force needed to relocalize replicated oriC’s to the opposite cell pole. The ParB-oriC complex is then stably attached to the cell pole, where it remains and the cell divides in-between the segregated chromosomes. The phenotypic consequences of mutation of parA or parB include reduced growth rates, a high frequency of anucleate cells and altered cell lengths. Also, in the absence of parA, the oriC is mislocalized. To date, polar origin tethering factors have been identified in only few bacteria. Thus, we wanted to identify and analyze the Actinobacteria chromosome polar targeting factor. A synthetic in vivo approach was employed to analyze the anchoring of the ParB-oriC nucleoprotein complex to the cell poles via interaction with DivIVA. It was shown that DivIVA is necessary and sufficient to recruit ParB, therefore also tether the oriC at the cell poles. With this synthetic system, in combination with mutational analysis, the interaction sites between ParB and DivIVA were mapped. In Corynebacterium glutamicum, mutation of the N-terminal of ParB showed reduced polar oriC localization. In addition, the interaction between ParB and DivIVA was demonstrated for other members of the Actinobacteria phylum, including the notorious pathogen Mycobacterium tuberculosis and Streptomyces coelicolor. Corynebacterium glutamicum, which undergoes cell division between the segregated nucleoids but not necessarily precisely at midcell, does not possesses the conventional positive or negative FtsZ regulators found in other rod-shaped bacteria. However, Corynebacterium glutamicum encodes an orphan parA-like gene (pldP, for ParA-like Division Protein). In this thesis a number of subtle differences between ParA and PldP were highlighted, showing that PldP is not involved in chromosome segregation, but probably in regulation of cytokinesis. Similar to the MinD protein of B. subtilis, PldP contains a putative C-terminal amphipathic helix. In vivo, PldP localizes, probably early, to the division septum and the localization pattern is highly reminiscent of MinD. Further in vitro analysis showed that PldP can bind membranes. Contrary to the long-standing assumption, some Corynebacterium glutamicum strains encode an actin homologue. The cg1890 (designated AlpC, for Actin-Like Protein Corynebacterium) gene was recently identified as a putative actin-like protein. At the sequence level, AlpC shares little homology with actin and other actin-like proteins, however, it does contain the actin signature motive involved in nucleotide binding and hydrolysis. In vivo, AlpC forms dynamic structures, which assemble into long straight filaments and dissemble into foci. In vitro, AlpC can hydrolyze both ATP and GTP and exhibits nucleotide dependent polymerization. Mutation of the actin signature motif (AlpCD301A) abolishes nucleotide hydrolysis but not polymerization. Thus, AlpC is a genuine member of the actin-like superfamily. On the genome, alpC is one of the first on the CGP3 prophage region. This prophage no longer forms infectious phage particles and most of the coding regions show little homology to known bacterial genes. The CGP3 prophage can excise from the bacterial chromosome and exist as multiple copies of circular DNA. In vivo co-visualization of induced prophage and AlpC filaments suggests that the Corynebacterium glutamicum actin-like protein is not involved in segregation of the prophage particles. However, in the absence of alpC, the frequency of prophage induction is drastically reduced. Thus, we speculate that AlpC plays a role in replication the CGP3 prophage.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Das Chromosom-Partitionierungs-System des keulenförmigen Aktinomycets Corynebacterium glutamicum besteht aus einer „Walker-type“ ATPase (ParA), einem DNA-Bindeprotein (ParB) sowie zentromeren parS-Sequenzen, die sich an einer ursprungsnahen Region auf dem Chromosom befinden. ParB bindet spezifisch an parS-Sequenzen. ParA wird an den ParB-parS Nukleoprotein-Komplex rekrutiert und stellt dabei die treibende Kraft zur Verlagerung der replizierten oriC’s zum gegenüberliegenden Zellpol. Der ParB-oriC Komplex wird dann stabil an den Zellpol gebunden sodass die Zellteilung zwischen den getrennten Chromosomen stattfinden kann. Phänotypische Konsequenzen nach Mutationen von parA und parB sind reduziertes Wachstum, eine hohe Anzahl DNA-freier Zellen sowie veränderte Zellängen. Des Weiteren ist die oriC in Abwesenheit von ParA misslokalisiert. Bis heute wurden Mechanismen zur polaren Chromosomenbindung nur in wenigen Bakterien identifiziert. Ein Ziel dieser Arbeit ist die Identifizierung und Charakterisierung des Chromosomsegregations-Mechanismus in Aktinobakterien. Zur Untersuchung der polaren Verankerung des ParB-oriC Nukleoprotein-Komplexes als Folge einer Interaktion mit DivIVA wurde ein synthetischer in vivo Ansatz etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass DivIVA nötig und ausreichend ist um ParB, und somit den oriC, an die Zellpole zu rekrutieren. Des Weiteren konnte in dem in vivo Assay, zusammen mit Mutationsanalysen, die Bindestellen von ParB und DivIVA identifiziert werden. In Corynebacterium glutamicum führte eine Mutation des N-Terminus von ParB zu einer reduzierten polaren oriC-Lokalisation. Darüber hinaus konnte die Interaktion zwischen ParB und DivIVA für weitere Mitglieder der Abteilung der Aktinobakterien gezeigt werden, inklusive dem Krankheitserreger Mykobakterium tuberculosis sowie Streptomyces coelicolor. Corynebacterium glutamicum, dessen Zellteilung zwischen den getrennten Chromosomen aber nicht zwangsläufig an der exakten Zellmitte stattfindet, besitzt keine konventionellen positiven oder negativen FtsZ-Regulatoren, die man in anderen keulenförmigen Bakterien findet. Jedoch kodiert Corynebacterium glutamicum ein parA-ähnliches Gen (pldP, engl.: ParA-like Division Protein). In der vorliegenden Arbeit werden einige subtile Unterschiede zwischen ParA und PldP beschrieben, die zeigen, dass PldP keine Rolle in der Chromosomensegregation spielt, vermutlich aber in der Zellteilung. Ähnlich dem MinD Protein aus Bacillus subtilis enthält PldP eine mögliche C-terminale amphipatische Helix. In vivo lokalisiert PldP, wahrscheinlich zu einem frühen Zeitpunkt des Zellzyklus, an das Zellteilungsseptum und gleicht somit dem Lokalisationsverhalten von MinD. Außerdem haben in vitro Studien gezeigt, dass PldP an Membranen bindet. Gegensätzlich langjähriger Annahmen kodieren einige Corynebacterium glutamicum Stämme ein Homolog zum eukaryotischen Aktin. Das Gen cg1890 (umbenannt zu AlpC, engl.: Actin-like Protein Corynebacterium) wurde kürzlich als mögliches Aktin-ähnliches Protein identifiziert. Obwohl AlpC nur wenige Sequenzhomologien zum Aktin sowie anderen Aktin-ähnlichen Proteinen hat, enthält es das typische Aktinmotiv, dass in Nukleotidbindung und Hydrolyse involviert ist. In vivo bildet AlpC dynamische Strukturen die zu langen Filamenten assemblieren bzw. Foki disassemblieren können. In vitro kann AlpC sowohl ATP als auch GTP hydrolysieren und nukleotidabhängig polymerisieren. Mutationen im Aktin-typischen Motiv verhindert Nukleotidhydrolyse jedoch nicht die Polymerisation. Somit ist AlpC ein Mitglied der Aktin-ähnlichen Superfamilie. Im Genom ist alpC eines der ersten Gene der CGP3 Prophagenregion. Dieser Prophage ist nicht mehr in der Lage infektiöse Phagenpartikel zu formen und die meisten Kodierungsregionen zeigen wenig Homologie zu bekannten bakteriellen Genen. Der CGP3 Prophage kann sich vom bakteriellen Chromosom trennen und als vielfache Kopie zirkulärer DNA existieren. In vivo Co-Visualisierungen induzierter Prophagen- und AlpC-Filamente lässt vermuten, dass das Aktin-ähnliche Protein aus Corynebacterium glutamicum in der Segregation der Prophagenpartikel keine Rolle spielt. Jedoch ist in Abwesenheit von alpC die Häufigkeit der Prophageninduktion drastisch reduziert. Daher wird vermutet, dass AlpC eine Rolle in der CGP3 Prophagenreplikation spielt. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Donovan, Catriona cdonovan@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Contributors:	Contribution Name Email UNSPECIFIED Donovan, Catriona cdonovan@uni-koeln.de
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-47308
Date:	19 June 2012
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Cell division, chromosome segregation English
Date of oral exam:	11 June 2012
Referee:	Name Academic Title Kraemer, Reinhard Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4730