Differential glycomics of epithelial membrane glycoproteins from urinary exovesicles reveals shifts towards complex-type N-glycosylation in classical galactosemia

Staubach, Simon (2012). Differential glycomics of epithelial membrane glycoproteins from urinary exovesicles reveals shifts towards complex-type N-glycosylation in classical galactosemia. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Classical galactosemia is caused by deficiency of the enzyme galactose-1-phosphate uridyltransferase (GALT). The reason for the deficiency is a specific gene mutation causing an amino acid exchange near the active site of the enzyme. The turnover rate of the enzyme is therefore more than thousand-fold decreased. Dietary galactose uptake, for instance drinking milk, is followed by an intracellular stress response. The co-substrate of the GALT galactose-1-phosphate accumulates intracellularly and disturbs carbohydrate-dependent metabolic pathways and presumably the Leloir pathway. The Leloir pathway supplies UDP-galactose and UDP-glucose for glycosylation of proteins and lipids. UDP-galactose incorporation is necessary, for example, to build up complex-type antennae of N-glycans on glycoproteins. It was supposed that, if the Leloir pathway is affected, the N-glycosylation, especially galactosylation in complex-type chains, will be affected. For examination of changes in glycosylation patterns mass spectrometric glycomics methods were chosen as most suitable. The N-linked carbohydrate branches were detached by PNGaseF digestion and analyzed applying matrix-assisted laser ionization mass spectrometry after glycan methylation. For examination of glycan pattern changes we isolated vesicles, mainly exosomes from urine of galactosemia patients as easily accessible source of epithelial membranes, and compared the N-glycome with the corresponding samples of healthy controls. The comparison of the mass spectra reveals a dramatic glycosylation shift from prevalent high-mannose-type N-glycans found in healthy controls towards complex-type glycosylation in patients. The estimated ratio of the amounts of high-mannose-type versus complex-type was about 3:1 respecting the healthy control samples. Especially the N-glycans that either carry five or six mannoses were detected as most abundant. In contrast the ratio for patients shifted to nearly 1:1 towards complex-type glycosylation. The most abundant complex-type glycans from exovesicular membranes of GALT-deficient patients were of bi-antennary structure, terminal disialylated and without core fucosylation. Glycans with higher antennary branching were found in marginal amounts, only. The observed glycosylation shift can be regarded as a new finding and it may be assumed that not only secreted proteins like transferrin become dysglycosylated in galactosemia. Furthermore, cell surface located glycoproteins, especially receptors, were affected. Changes in glycosylation patterns were suspected to be responsible for missorting of glycoproteins especially for glyco-receptors like the EGFR (epidermal growth factor receptor) which is regularly expressed at apical membranes of epithelial cells. Quantitative and qualitative alterations of membranous exosomal glycoproteins indirectly provide information of alterations at the cell membrane. To study alterations of glycoproteoms, especially glyco-receptors, in exosomal lipid rafts, an iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation) labeling was chosen as suitable for a quantitative in vitro experiment based on urinary exosomes. Four different individual samples were selected: two galactosemic samples (from patients showing drastic shifts from high-mannose to complex-type N-glycosylation) and two healthy controls. The samples were labeled with the isobaric tags, mixed and analyzed by offline nano-LC MALDI-MS/MS (liquid chromatography-matrix-assisted laser desorption-ionization-mass spectrometry). Although EGFR was not detected in the experiment we found strongly increased amounts of N-glycoproteins and some receptors associated with galactosemic exosomes: tyrosine-protein kinase receptor UFO, zinc-alpha-2-glycoprotein (ZA2G, MHC I -family) and aminopeptidase N (CD13), to name some. The cubilin receptor and megalin were also found. They dimerize to form the megalin-cubilin-complex and are responsible for protein reabsorption at the proximal tubulus of the nephritic kidney. This cubilin receptor was detected in a further experiment to be one of the major differences between samples of galactosemia patients and control persons. Finally, the iTRAQ experiment revealed another unexpected result. The samples of the galactosemia patients contained increased amounts of serum proteins, in particular N-glycoproteins. A large variety of immunoglobulins were found increased; further albumin, fetuin, transferrin and many more. All together these results strongly suggest renal failure for these examined galactosemic patients. Biopsy is usually the most common method to detect renal diseases. The examination of urinary exosomal samples therefore possibly represents a new diagnostic method to detect renal failure without surgical intervention.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Die differenzielle Glykomik epithelialer Membranglykoproteine von urinären Exovesikeln zeigt eine Verschiebung in Richtung auf Komplex-Typ N-Glykosylierung in klassischer Galaktosämie an	German

Translated abstract:

Abstract

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Die klassische Galaktosämie wird durch eine defiziente Transferase verursacht, die Glaktose-1-phosphat-Uridyltransferase (GALT). Ursache dieser Defizienz ist eine genetisch vererbte Mutation, die einen Aminosäureaustausch am aktiven Zentrum des Enzyms bewirkt. Die Wechselrate des Enzyms wird hierdurch um mehr als das Tausendfache reduziert. Exogene Galaktoseaufnahme insbesondere aus Milchprodukten induziert eine intrazelluläre Stressantwort. Das Co-Substrat der GALT, Galaktose-1-phosphat akkumuliert in der Zelle, beeinträchtigt den Zuckerstoffwechsel und wahrscheinlich den Leloir-Galaktosestoffwechsel. Der Leloir-Galaktosestoffwechsel stellt UDP-Galaktose und UDP-Glukose für die Glykosylierung von Proteinen und Lipiden bereit. Die UDP-Galaktose wird beispielsweise für die Synthese von N-Glykoproteinen des Complex-Typs benötigt. Es wurde angenommen, dass wenn der Leloir-Galaktosestoffwechesel beeinträchtigt ist, dies auch in der Galaktosylierung der Complex-Typ Glykane wiederzufinden sein wird. Um diese Veränderungen in Glykosylierungsmustern wiederzufinden, erwies sich die massenspektrometrische Glykananalyse als besonders aussagekräftig. Mithilfe des enzymatischen Verdaus durch PNGaseF konnten die N-Glykane von den Glykoproteinen abgelöst werden und anschließend, nach erfolgter Methylierung, unter Anwendung von Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Massenspektrometrie, vermessen werden. Um Veränderungen der Glykosylierungsmuster zu detektieren haben wir Vesikel aus dem Urin von Galaktosemiepatienten isoliert und die N-Glykosylierung der hier lokalisierten Glykoproteine mit denen von gesunden Kontollpersonen verglichen. Wir konnten zeigen, dass es sich bei den Vesikeln zum größten Teil um Exosomen handelt. Der Vergleich der Massenspektren ergab einen dramatischen N-Glykosylierungsshift von dem in gesunden Personen vorherrschenden High-mannose-Typ zum Complex-Typ. Der angenäherte Wert des Verhältnisses von High-mannose-Typ zu Complex-Typ Glykanen bei gesunden Kontrollpersonen betrug 3:1. Insbesondere die N-Glykane, bestehend aus fünf oder sechs Mannosen, waren in auffällig erhöhter Menge zu finden. Im Gegensatz hierzu veränderte sich die Mengenverteilung bei Galaktosämiepatienten in Richtung 1:1 zum Complex-Typ. Die meist vorhandene Struktur, die bei Galaktosämiepatienten auf Exovesikeln zu finden war, entsprach einem Complex-Typ Glykan mit einer bi-antennaren Struktur, die endständig disialyliert war und keine Kern-Fukose trug. Glykane, die eine höhere Verzweigung aufwiesen, konnten nur in sehr geringen Mengen detektiert werden. Der beobachtete Glykosylierungsshift ist als neuer Befund einzuordnen, denn bislang konnte eine veränderte Glykosylierung nur unter akutem Stress bei sekretierten Proteinen wie dem Transferrin festgestellt werden. Wenn diese Veränderung wie gezeigt membranäre Proteine betrifft, ist anzunehmen, dass auch glykosylierte Rezeptoren von diesem Ereignis betroffen sind. Veränderungen der Glykosylierungen können für eine Mislokalisation von Glykoproteinen verantwortlich sein, insbesondere könnte dies zutreffen für Glyko-Rezeptoren, wie dem EGFR (epidermal growth factor receptor), der üblicherweise auf der apikalen Seite von epithelialen Zellen exponiert wird. Quantitative und qualitative Veränderungen membrangebundener exosomaler Glykoproteine geben indirekt Auskunft über die Veränderungen auf der zellulären Membran. Wir konnten in Westernblots zeigen, dass die erhöhte Menge an EGFR, die in exosomale lipid rafts sortiert wird, korreliert, mit einer reduzierten Menge an EGFR in den plasmamembranären lipid rafts. Um die Veränderungen des Glykoproteoms insbesondere von Glykorezeptoren in exosomalen lipid rafts festzustellen, war eine Quantifizierung durch Labeling mit isobarischen Tags zur relativen und absoluten Quantifizierung (iTraq) sehr nützlich. Vier einzelne Proben von vier Individuen wurden hierzu ausgewählt: Zwei Proben von Galaktosämiepatienten und zwei gesunde Kontrollpersonen. Die beiden Proben der Galaktosmiepatienten zeigten den typischen Glykosylierungsschift von High-mannose zum Complex-Typ der vorangegangenen Studie. Die Proben wurden mit den isobaren Tags versehen, danach vereinigt und anschließend über nano-LC MALDI-MS/MS analysiert. Obwohl kein EGFR gefunden werden konnte, wurden erhöhte Mengen an N-Glykoproteinen und einigen Rezeptoren gefunden, die exosomenassoziiert vorlagen: Der Tyrosin-Proteinkinase-Rezeptor UFO, zinc-alpha-2-glycoprotein (ZA2G, MHC I–Familie) und Aminopeptidase N (CD13) sind hier zu nennen. Der Cubilin- und Megalin-Rezeptor wurden detektiert. Beide dimerisieren und formen einen Megalin-Cubilin-Komplex der für die Rückresorption von Proteinen aus dem proximalen Tubulus der Nephridien zuständig ist. Dieser Cubilinrezeptor wurde bereits in einem vorangegangenen Experiment als auffälligster Unterschied zwischen Proben von Galaktosämiepatienten und Kontrollpersonen festgestellt. Letztendlich wurde ein weiteres unerwartetes Ergebnis mittels iTRAQ-Methode ausgemacht. Die Proben der Galaktosämiepatienten enthalten stark angereicherte Mengen an Serumproteinen, besonders N-glykosylierte Serumproteine. Eine Vielzahl an Immunglobulinen waren erhöht, desweiteren Albumin, Fetuin, Transferrin und viele mehr. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse auf das Krankheitsbild einer Niereninsuffizienz bei Galaktosämie hin. Die übliche Methode um diesen Befund festzustellen war in der Vergangenheit die Organbiopsie. Die Untersuchung urinärer Exosomen, könnte in diesem Kontext eine innovative Methode darstellen, um ohne körperlichen Eingriff Nierenversagen feststellen zu können.

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