Universität zu Köln

Noetel, Andrea (2012). Bedeutung neuronaler microRNAs während der myofibroblastischen Transdifferenzierung hepatischer Sternzellen. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Chronische Lebererkrankungen, unabhängig von ihrer Ätiologie, münden in der Leberfibrose. Die Leberfibrose ist gekennzeichnet durch einen unkontrollierten Vernarbungsprozess, der mit einer deutlichen Akkumulation von extrazellulärer Matrix im interstitiellen Raum verbunden ist. Hepatische Sternzellen (HSC) stellen dabei den zentralen Zelltyp in der Deposition extrazellulärer Matrix dar, indem sie nach Aktivierung eine myofibroblastische Transdifferenzierung durchlaufen. Neben den Eigenschaften als Myofibroblast wurden in der Vergangenheit auch neuronale Marker für diese Zellen beschrieben. MicroRNAs spielen eine Rolle in diversen Zellprozessen, wie Entwicklung, Differenzierung und Apoptose. Diese kleinen, einzelsträngigen RNA-Moleküle haben die Funktion, Gene posttranskriptionell zu regulieren. Für die primär in neuronalen Geweben vorkommenden microRNAs miR-9, miR-125b und miR-128 ist eine Beteiligung in der neuronalen Differenzierung bekannt. Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung neuronaler miRNAs während der myofibroblastischen Transdifferenzierung von HSC untersucht. Dafür wurde zunächst die Isolierung primärer HSC etabliert, da dieses Zellsystem die in vivo ablaufenden Vorgänge während der Differenzierung auch in vitro widerspiegelt. Durch Real-Time-PCR-Quantifizierung konnte nachgewiesen werden, dass die Expression der neuronalen microRNAs miR-9, miR-125b und miR-128 während der in vitro-Transdifferenzierung primärer HSC hochreguliert wurde. Um vertiefend eine Bedeutung dieser microRNAs in HSC zu untersuchen, wurden verschiedene Ansätze zur Bestimmung der Zieltranskripte angegangen. Durch in silico-Analysen mit Hilfe von Datenbanken zeigten sich für miR-9, miR-125b und miR-128 Übereinstimmungen beim Vergleich ihrer potenziellen Ziel-mRNAs. Dabei konnten für das Transkript Lin28 in dessen 3`-untranslatierten Region (UTR) für miR-9, miR-125b, und miR-128 mögliche Bindungsstellen gefunden werden. Deshalb wurden die potenziellen Bindungssequenzen der einzelnen miRNAs sowohl als Wildtyp als auch als Mutante an das 3`-Ende eines Luziferase-Reporters flankierend kloniert und nach Co-Transfektion mit der miRNA in Reporterassays eingesetzt. Diese zeigten eine Interaktion der neuronalen miRNAs mit der 3`-UTR der Lin28 mRNA. Während der myofibroblastischen Differenzierung nahm die Expression von Lin28 stark ab. Dieser inverse Exressionsverlauf von Lin28 zu den neuronalen miRNAs spricht ebenfalls für einen direkten Einfluss von miR-9, miR-125b und miR-128 auf die Lin28 Expression. Zusätzlich zu Lin28 zeigte die Datenbankrecherche Klf4, einen weiteren Pluripotenzfaktor, als potenzielles Zieltranskript für miR-128. Die spezifische Interaktion von miR-128 mit der 3`-UTR von Klf4 konnte ebenfalls erfolgreich über einen Reporterassay dargestellt werden. In zwei weiteren Ansätzen zur Identifizierung möglicher Zieltranskripte in vitro wurde sowohl ein Hybridisierungs-Microarray als auch erstmals die Methode der Ago2-Immunopräzipitation eingesetzt. In den miR-128 behandelten HSC zeigten sich vor allem in der Microarray-Analyse viele Mitglieder der CC- und CXC-Chemokinfamilie als neue, nicht in den Datenbanken vorkommende Ziel-mRNAs für miR-128. Mit Hilfe der Ago2-Immunopräzipitation konnte eine direkte Interaktion der microRNA mit ihrem Zieltranskript im RNA induced silencing complex (RISC) in HSC analysiert werden. Die im RISC von den neuronalen miRNAs gebundenen Transkripte wurden primär durch Klonierung der cDNA mit direkter Sequenzierung und des Weiteren in einer umfangreichen Analyse durch Next Generation Sequencing identifiziert. In diesen Ansätzen wurden für miR-9, miR-125b, aber vor allem für die miR-128 erneut die Mitglieder der Chemokinfamilie als Bindungspartner der neuronalen miRNAs gefunden. Das in der Leberfibrose prädominante Chemokin Ccl2, das bereits durch die Expressionsprofilanalyse nach Überexpression von miR-128 durch eine verringerte Expression aufgefallen war, wurde auf seine direkte Interaktion mit miR-128 durch Reporterassays überprüft. Dabei konnte Ccl2 als Ziel-mRNA für diese neuronale microRNA bestätigt werden. In der myofibroblastischen Transdifferenzierung von HSC ist Ccl2 gegenläufig zur miR-128 Induktion reprimiert. Mit Hilfe des Next Generation Sequencing wurde in Übereinstimmung zu den in silico-Daten zusätzlich Notch1 als Zieltranskript für die neuronalen microRNAs identifiziert. In jüngster Vergangenheit wurde Notch1 als ein wesentlicher Faktor, der die myofibroblastische Transdifferenzierung von HSC hemmt, diskutiert. In der vorgestellten Arbeit wurde für die drei neuronalen microRNAs eine spezifische Interaktion mit der 3`-UTR von Notch1 dargelegt. Mit der Hochregulierung von miR-9, miR-125b und miR-128 während der Transdifferenzierung von HSC konnte umgekehrt eine Herunterregulierung von Notch1 auf Transkript- und Proteinebene veranschaulicht werden. Daher hat die hier gezeigte Interaktionsachse von neuronalen miRNAs und Notch1 eine besonders hohe Bedeutung für den Initiierungsmechanismus der myofibroblastischen Transdifferenzierung.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Chronic liver diseases, independent of their etiology, are leading to liver fibrosis, that is characterized by an uncontrolled scarring process and an enormous acculumation of extracellular matrix in the interstitial space. Hepatic stellate cells (HSC) are the main cell type responsible for the deposition of extracellular matrix after inflammatory induced myofibroblastic activation. Despite their myofibroblastic features HSC are also reported to exhibit expression of neuronal structural proteins and signaling mediators. MicroRNAs play an important role in diverse cellular processes such as development, differentiation, and apoptosis. These small single-stranded RNA molecules regulate gene expression on the post-transcriptional level. The miRNAs miR-9, miR-125b, and miR-128, prevalently expressed in neuronal tissue are known to be involved in neuronal differentiation. In the present thesis work, the relevance of neuronal miRNAs was analyzed during myofibroblastic transdifferentiation of HSC. First, the isolation procedure of primary HSC was established. This in vitro cell system of primary HSC reflects the the cellular mechanisms of fibrogenesis in vivo. In the present study the upregulation of the neuronal miR-9, miR-125b, and miR-128 was shown during in vitro induced transdifferentiation of primary HSC by real-time PCR. To analyze the impact of these miRNAs in HSC, different approaches were performed to identify potential target transcripts. In silico analyses of databases revealed identification of common potential targets probably recognized by all three miR-9, miR-125b, and miR-128. Thus, the Lin28 transcript was found to have putative binding sites for miR-9, miR-125b, and miR-128 in the 3`-untranslated region (UTR). Therefore, the potential binding sequences of each neuronal miRNA and corresponding sequences including two point mutations were cloned into a luciferase reporter plasmid and used for reporter assays after miRNA co-transfection. Reporter assays showed that all neuronal miRNAs interact with the 3`-UTR of the Lin28 mRNA. During myofibroblastic transdifferentiation the expression of Lin28 was markedly decreased. This contrary expression of Lin28 and the neuronal miRNAs also illustrates the direct effect of miR-9, miR-125b, and miR-128 on the Lin28 expression. Additionally, Klf4 as another factor of pluripotency was listed as putative target transcript of miR-128 in the databases. The specific interaction of miR-128 with the 3`-UTR of Klf4 was also demonstrated by a reporter assay. For identification of putative target transcripts in vitro two further approaches were performed, a hybridization microarray and an Ago2 immunoprecipitation assay, approached for the first time in the present thesis work. Interestingly, in miR-128 treated HSC, members of the CC- and CXC-chemokine families, not yet listed in the databases, were identified as new target mRNAs of miR-128, in particular by the microarray analysis. By Ago2 immunoprecipitation the direct interaction of the miRNA with its target transcript, taking place in the RNA-induced silencing complex (RISC) of HSC, was analyzed. Transcripts, bound by neuronal miRNAs in the RISC, were identified first by cloning of the corresponding cDNA followed by a direct sequencing and second by an extensive next generation sequencing analysis. By these approaches, members of the chemokine familiy were confirmed as binding partners for miR-9, miR-125b, and especially for miR-128. Ccl2, as the predominant chemokine in fibrosis, showed a reduced expression in the expression profile analysis of miR-128 treated HSC and a direct interaction of miR-128 with the Ccl2 transcript was proven by reporter assays. Whereas miR-128 is induced, Ccl2 is repressed during myofibroblastic transdifferentiation of HSC. By means of next generation sequencing, Notch1 was identified as an additional target transcript of the neuronal miRNAs, in agreement with the in silico data. Recently, Notch1 was discussed as a main factor inhibiting the myofibroblastic transdifferentiation. In my thesis work, a specific interaction of the three neuronal miRNAs with the 3`-UTR of Notch1 was now demonstrated. While miR-9, miR-125b, and miR-128 were upregulated during myofibroblastic transdifferentiation of HSC, Notch1 is reduced, shown on transcript and protein level. Therefore, the here shown interaction between the neuronal miRNAs and Notch1 emphasizes the high relevance of this post-transcriptionally regulatory miRNA/Notch axis in the initiation mechanism of the myofibroblastic transdifferentiation. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Noetel, Andrea UNSPECIFIED UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-47712
Date:	April 2012
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language microRNA German hepatische Sternzellen German
Date of oral exam:	20 June 2012
Referee:	Name Academic Title Nürnberg, Peter Prof. Dr. Paulsson, Mats Prof. Dr. Odenthal, Margarete PD Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4771