Universität zu Köln

Sotiriadou, Isaia (2012). Development and application of molecular tools for the detection of the human pathogenic protozoan Giardia, Cryptosporidium and Toxoplasma. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Es besteht ein enormer Bedarf an der Entwicklung effektiver molekularer Methoden, die die Nachteile bisheriger Nachweisverfahren für parasitäre Protozoen wie Giardia, Cryptosporidium und Toxoplasma überwinden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Anwendung der Loop mediated-isothermal-amplification (LAMP) Technik zum Nachweis von Cryptosporidium und Toxoplasma. Darüber hinaus wurde eine phylogenetische Analyse von aus Haustieren isolierten Giardia und Cryptosporidium durchgeführt. SNP basierende SAM-LAMP-Methode für Cryptosporidium Das auf der Amplifizierung des SAM-Gens basierende SNP- (single nucleotid polymorphism-) LAMP-Verfahren wurde anhand der entsprechenden Nukleotid-sequenzen für den spezifischen Nachweis der wichtigsten humanpathogenen Cryprosporidium-Arten (C. parvum, C. hominis und C. meleagridis) entwickelt, anschließend in Wasser- sowie klinischen und Tierproben angewendet. Für die Speziescharakterisierung der Proben wurde die Methode mit zwei nPCR-Methoden verglichen, die auf dem Nachweis des SSU rRNA-Gens mit der Amplifizierung von 435 bp und einer 850 bp langen polymorphen Regionen des Gens beruhen. Das auf SNP basierende SAM-LAMP-Verfahren wurde mit den Ergebnissen des Immunofluoreszenz-Tests (IFT) für Cryptosporidium und mit dem zuvor entwickelten GP60-LAMP-Verfahren zum ausschließlichen Nachweis von C. parvum verglichen. Die ermittelte Nachweisgrenze von 800 fg/µl entspricht 0,1 Cryptosporidium- Oozysten. Das entwickelte Verfahren wurde zunächst an 53 Wasserproben, die mit einer bekannten Anzahl an Cryptosporidium-Oozysten kontaminiert wurden, getestet. Die Sensitivität bei dem LAMP-Verfahren betrug 100% für die aufgestockten Proben, während die Sensitivität beider PCRs bei nur 3% und 7% lag. Bei den gleichen ursprünglichen (natürlichen) Proben wurden mittels auf SNP basierendem SAM-LAMP-Verfahren 50% und mittels GP60-Verfahren 24% Cryptosporidium DNA-Positive ermittelt; mit den nPCR Verfahren wurden hingegen nur 5% bzw. 7% Positivergebnisse generiert. Von 15 Wasserproben aus Thailand waren 12 (80%) positiv; ebenso positiv waren 4 von 8 (50%) Muschelproben, 11 von 44 (25%) Stuhlproben von HIV/AIDS Patienten und 12 von 22 (55%) tierischen Fäkalproben. Mit dem GP60-LAMP-Test und den beiden nPCR-Verfahren konnte vergleichsweise eine geringere Anzahl an positiven Proben ermittelt werden als durch SNP-basierende LAMP-Verfahren. Unter den durch Sequenzanalyse identifizierten Arten aus den untersuchten Proben war C. parvum am häufigsten, gefolgt von C. hominis in einer Muschelprobe, C. andersoni in einer tierischen Fäkalprobe und C. fragile in einer Wasserprobe. B1 und TgOWP LAMP-Methode für den Nachweis von Toxoplasma in Wasserproben Das auf der Amplifizierung der B1 und TgOWP-Gene basierende LAMP-Verfahren wurde für den schnellen Nachweis von Toxoplasma gondii in Wasserproben entwickelt und evaluiert. Die Nachweisgrenze der LAMP lag für beide Gene bei 0,1 Tachyzoiten-DNA. Das LAMP-Verfahren wurde vorher evaluiert und an 26 mit Toxoplasma-Oozysten aufgestockten Wasserproben mit der nested PCR verglichen. Die LAMP-Sensitivität betrug 100%, hingegen erreichte die nPCR der gleichen Proben nur 53.8% bei den gleichen aufgestockten ursprünglichen Wasserproben. Der Vergleich von IFT, LAMP und nPCR anhand von 52 ursprünglichen Wasserproben zeigte, dass 25 (48%) der mittels LAMP untersuchten Proben und keine mit IFT–Verfahren untersuchten Proben positiv waren, während nPCR- untersuchte in 7 (13,5%) der Proben generiert wurden. Haustierinfektionen und phylogenetische Analyse von Giardia und Cryptosporidium Die molekulare Diagnose von Giardia-Zysten und Cryptosporidium-Oozysten von Haustieren mit Ursprung aus Deutschland mittels nPCR und Sequenzanalyse war ein Teilgegenstand dieser Arbeit. Die Tierkotproben wurden im Anschluss an die Amplifizierung des Glutamat-Dehydrogenase-Locus (GDH Locus) auf das Vorhandensein von Giardia und die SSU-rRNA auf das Vorhandensein von Cryptosporidium untersucht. Von den 81 untersuchten Hunden und 19 Katzen wurde Giardia Assemblage A in Isolaten von fünf Hunden und zwei Katzen identifiziert. Bei Cryptosporidium-Isolaten aus einem Hund und einer Katze handelte es sich jeweils um C. parvum. In einem Hundeisolat lag eine Mischinfektion von C. parvum und Giardia Assemblage A vor. Diese Ergebnisse liefern einen deutlichen Hinweis darauf, dass die anthropozoonotischen Krankheitserreger Giardia spp. und Cryptosporidium spp. in Haustieren ein mögliches Infektionsreservoir für die Populationen von Mensch und Tier darstellen. Im Vergleich zu anderen molekularbiologischen Methoden ist das LAMP-Verfahren wegen seiner hohen Sensitivität und Spezifität eines der besten molekulardiagnostischen Verfahren zum Nachweis der humanpathogenen Protozoen Cryptosporium und Toxoplasma in Umweltproben, klinischem Material und Nahrungsmitteln. Die Anwendung der LAMP-Technik, kombiniert mit der PCR-Sequenzierung, kann zu einem schnellen Speziesnachweis, zur Differenzierung von für die Bevölkerung gesundheitsrelevanten Spezies sowie zur Identifizierung von Kontaminationsquellen dienen. Die LAMP-Anwendung hat das Potenzial, ein Werkzeug für den schnellen Nachweis dieser wichtigen anthropozoonotischen Spezies, für die menschliche und tierische Wirte anfällig sind, zu sein. Diese Methode kann dazu beitragen, der Kontrolle und Prävention von Krankheiten zu dienen und das Gesundheitsrisiko für die Bevölkerung durch nahrungsmittel- und wasserbürtige (Oo)zysten einzuschätzen.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language There is an ongoing demand for development of different molecular tools toward achieving a better fundamental method that overcomes the limitation barriers and the drawbacks of other methods for an effective detection of protozan Giardia, Cryptosporidium and Toxoplasma. Within the present thesis, a method has been developed for detection of the human pathogenic species, Cryptosporidium and Toxoplasma, applying the Loop mediated isothermal amlification (LAMP) technique. Beyond this, the phylogenetic analysis of Giardia and Cryptosporidium from houshold animals has been performed. SNP based SAM-LAMP assay for Cryptosporidium The single nucleotide polymorphism (SNP)-LAMP assay based on the SAM gene amplification was developed to detect specifically the most important human pathogenic species of Cryptosporidium (C. parvum, C. hominis and C. meleagridis), according to the available nucleotide sequences, and it was applied in water, clinical and animal samples. The assay was compared with two nested PCR-assays based on the SSU rRNA gene amplifying a 435 bp and 850 bp long polymorphous region of the gene for the species characterisation of the samples. The SNP based SAM-LAMP assay was additionally compared with the results from the IFT-test for Cryptosporidium species and with the previously developed GP60-LAMP assay able to detect only C. parvum infections. The sensitivity detection limit was 800 fg/µl which corresponds to 0.1 Cryptosporidium oocysts. The developed assay was initially tested in 53 water sample pellets spiked with known numbers of Cryptosporidium oocysts. The detection sensitivity for the spiked pellets was 100% for both LAMP assays (GP60 and SNP based SAM-LAMP assays), while both nPCRs showed sensitivities of only 3% and 7%. In the same natural water samples 50% were found to be positive for Cryptosporidium DNA by the SNP based SAM-LAMP assay and 24% were positive by the GP60-LAMP assay; the nPCR assays generated products only in 5% and 7% of the samples. When the method was applied in water samples from Thailand 12 out of 15 (80%) samples were found positive, in 4 out of 8 mussel samples (50%), in 11 of 44 HIV/AIDS patient fecal samples (25%) and in 12 out of 22 (55%) animal fecal samples were found positive. The GP60-LAMP and the two nPCR assays detected lower numbers of positive samples than the SNP based LAMP assay. Among the species identified from the investigated samples by sequencing analysis, the most commonly detected species was C. parvum, followed by C. hominis in one mussel sample, C. andersoni in one animal fecal and C. fragile in one water sample. The present work reports for first time the presence of C. fragile in water samples. B1 and TgOWP LAMP assays for Toxoplasma detection in water samples The LAMP assay was developed and evaluated for the rapid detection of Toxoplasma gondii in water samples based on the amplification of B1 and TgOWP Toxoplasma genes. LAMP demonstrated a sensitivity detection limit of 0.1 tachyzoites’ DNA for both genes and subsequently the LAMP detection technique was evaluated and compared with the nested PCR in 26 water samples pellets spiked with Toxoplasma oocysts. LAMP showed a sensitivity of 100%, whereas PCR only 53.8% when applied in the same spiked environmental water samples. The comparison of the IFT, LAMP and PCR in the 52 natural water samples demonstrated that 25 (48%) of the samples were positive for Toxoplasma-DNA by LAMP, none by IFT, while nested PCR products were generated in 7 (13.5%) water samples. Infections of household animals and phylogenetic analysis of Giardia and Cryptosporidium from Germany The molecular diagnosis of Giardia cysts and Cryptosporidium oocysts in household animals mainly with origin from Germany using nPCRs and sequence analysis was the subject of this part of this work. The animal fecal samples were investigated after the amplification of the glutamate dehydrogenase locus (GDH) locus for the presence of Giardia species and the SSU rRNA for the presence of Cryptosporidium species. Of the 81 dogs and 19 cats investigated, the zoonotic Assemblage A of Giardia was identified in isolates from five dogs and two cats. Cryptosporidium spp. were isolated from one dog and one cat, where both found to be C. parvum. One dog isolate harboured a mixed infection of C. parvum and Giardia Assemblage A. These findings support the growing evidence that the anthropozoonotic pathogens Giardia spp. and Cryptosporidium spp. in household animals are potential reservoirs for infections in human and animal populations. Comparatively to other molecular methods LAMP is ranked among the most accuarate molecular tools through its high diagnostic sensitivity and specificity for the accurate detection of the human pathogenic protozoan Cryptosporidium and Toxoplasma in environmental, clinical and food material. The application of the LAMP technique, coupled with the PCR-sequencing approach, would contribute for the rapid detection and differentiation of species of public health significance and the identification of the sources of contamination. The stand-alone application of the LAMP assay has the potential to become a rapid diagnostic tool for the control and prevention of protozoan-related diseases and will contribute for a better assement of the risk to public health from food- and waterborne (oo)cysts. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Sotiriadou, Isaia sisaia1@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-47852
Date:	15 June 2012
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Zoologisches Institut
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) English Immunofluorescence Test (IFT) UNSPECIFIED Giardia UNSPECIFIED Toxoplasma UNSPECIFIED Cryptosporidium UNSPECIFIED Polymerase Chain Reaction (PCR) UNSPECIFIED Water UNSPECIFIED
Date of oral exam:	15 June 2012
Referee:	Name Academic Title Arndt, Hartmut Prof. Dr. Korsching, Sigrun Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4785