Eine hypofunktionelle Mutation in der Polynukleotid-Phosphorylase führt zu einer autosomal-rezessiven nicht-syndromalen Hörstörung

Ameln, Simon von (2011). Eine hypofunktionelle Mutation in der Polynukleotid-Phosphorylase führt zu einer autosomal-rezessiven nicht-syndromalen Hörstörung. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Hörstörungen sind beim Menschen mit einer Prävalenz von 1 bis 2 auf 1000 Neugeborene die häufigste Erkrankung der Sinnesorgane. Kongenitale Hörstörungen können sowohl genetische als auch umweltbedingte Ursachen haben, wobei in Industrieländern mindestens 50-60% der Fälle frühkindlicher Taubheit auf eine genetische Ursache zurückzuführen sind. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der ursächliche Gendefekt identifiziert werden, der in einer konsanguinen marokkanischen Familie für eine nicht-syndromale Form autosomal-rezessiver Hörstörung verantwortlich ist. In der untersuchten Familie sind drei Kinder von Geburt an taub, die Eltern und drei weitere Kinder sind nicht betroffen. Nachdem Mutationen in GJB2, dem häufigsten Taubheitsgen, ausgeschlossen werden konnten, wurde anhand der acht Familienmitglieder eine genomweite Kopplungsanalyse durchgeführt. Diese ergab einen putativ gekoppelten Locus mit einem LOD-Score von 2,7 auf Chromosom 2 und einen weiteren mit einem LOD-Score von 1,5 auf Chromosom 12. Durch die Analyse von zusätzlichen Mikrosatelliten-Markern konnte, da betroffene Individuen nicht den gleichen Haplotypen aufwiesen, der Locus auf Chromosom 12 ausgeschlossen werden. Die Kopplung des Locus auf Chromosom 2 hingegen konnte bestätigt werden. Diese Kandidatengenregion, die durch die Mikrosatellitenmarker D2S119 und D2S378 begrenzt wird, wurde entsprechend der Nomenklatur für autosomal-rezessive Taubheitsloci DFNB70 benannt und ist auf der Hereditary Hearing Loss Homepage registriert. Der DFNB70-Locus umfasst 13,2 Megabasen mit 49 annotierten Genen. Durch direktes Sequenzieren der kodierenden Exons und angrenzenden Spleiß-Stellen aller Gene innerhalb der gekoppelten Region wurde bei betroffenen Individuen eine einzelne homozygote nicht-annotierte Missense-Veränderung in dem Gen PNPT1 identifiziert. Der Austausch von Adenin nach Guanin an der Nukleotidposition 1424 (c.1424A>G) in PNPT1 hat auf Proteinebene eine Substitution von Glutaminsäure zu Glycin (p.E475G) zur Folge. Weder in mehr als 400 gesunden Kontrollindividuen unterschiedlicher ethnischer Herkunft noch in Datenbanken wie dbSNP oder dem Exome Variant Server konnte diese Mutation gefunden werden, wodurch ausgeschlossen werden konnte, dass es sich um einen häufigen Polymorphismus handelt. Die Polynukleotid-Phosphorylase (PNPase), die von PNPT1 kodiert wird, ist ein evolutionär hochkonserviertes Protein, das in Bakterien am RNA-Metabolismus beteiligt ist. Bei Säugetieren ist die PNPase im Intermembranraum von Mitochondrien lokalisiert und stellt das bisher einzig bekannte Protein dar, das den Import von RNAs in Mitochondrien vermittelt. Dieser Prozess ist sowohl für die Replikation als auch für die Transkription des mitochondrialen Genoms notwendig. Die kodierende Sequenz des PNPT1-Orthologs im Zebrafisch, welches bis dato nicht annotiert gewesen ist, konnte vollständig identifiziert und kloniert werden. Mittels in situ Hybridisierung konnte die Expression von PNPT1 in frühen Entwicklungsstadien des Zebrafisches aufgeklärt werden. Vergleichbar mit der embryonalen Letalität der bereits beschriebenen PNPT1-Knockout-Maus führte ein Morpholino-Knockdown des PNPT1-Gens zu schweren Störungen der frühen Zebrafischentwicklung. Sowohl für die Maus als auch für den Zebrafisch scheint die Funktion der PNPase von essentieller Bedeutung zu sein. Der immunhistochemische Nachweis der PNPase in der murinen Cochlea konnte deren Expression in dem betroffenen Organ, darunter insbesondere in den Haarzellen und in den Neuronen der Spiral- bzw. Vestibularganglien, belegen. In vitro Analysen in Bakterien, in der Hefe und in Säugetierzellen ergaben, dass die E475G Mutation ein hypofunktionelles Allel darstellt. In Komplementationsversuchen konnte z.B. gezeigt werden, dass exogen exprimierte bakterielle Wildtyp-PNPase das Wachstumsdefizit eines PNPase defizienten E. coli-Stämms signifikant besser ausgleichen konnte, als die entsprechende PNPase-Mutante. Sowohl in der Hefe als auch in Säugetierzellen sind die Trimerisierung der PNPase und der mitochondriale RNA-Import der RNase P RNA durch die E475G-Mutation beeinträchtigt. Der verringerte Import der RNase P RNA hat vermutlich zur Folge, dass die Prozessierung mitochondrialer Transkripte durch die RNase P gestört ist, wodurch es zu einer Akkumulation von unprozessierten Transkripten in der mitochondrialen Matrix kommen würde. Ähnlich wie durch Mutationen in mitochondrialen Genen, die bekanntermaßen zu Hörstörungen führen können, könnte die Akkumulation dieser Transkripte eine Erklärung für die Taubheit in der untersuchten Familie sein. Zusammenfassend konnte erstmalig gezeigt werden, dass eine beeinträchtigte Funktion der PNPase mit wahrscheinlich reduziertem mitochondrialen RNA-Import zu einer erblichen Hörstörung beim Menschen führen kann.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Abstract

Language

Hearing loss is the most frequent disorder of the sensory organs in humans, affecting 1 to 2 out of 1,000 newborns. Congenital deafness may be due to environmental or genetic factors with genetic factors being the cause of at least 50 - 60% of the prelingual cases in developed countries. The aim of this study was to identify the causative genetic defect leading to autosomal-recessive hearing loss in a consanguineous Moroccan family. In the investigated family three children were deaf from birth, whereas the parents and three other children are unaffected. After the exclusion of mutations in the most frequent deafness gene GJB2, a genome-wide linkage analysis was performed in the eight family members. Two putative linked regions were discovered, i.e. one on chromosome 2 and another on chromosome 12 with LOD scores of 2.7 and 1.5, respectively. The locus on chromosome 12 could be excluded by the analysis of additional microsatellite markers, which showed that affected individuals did not share the same haplotype. In contrast, linkage could be confirmed for the locus on chromosome 2. According to the nomenclature for deafness loci the linked region on chromosome 2, which is flanked by the microsatellite markers D2S119 and D2S378, was named DFNB70 and has been registered at the Hereditary Hearing Loss Homepage. The DFNB70 locus covers 13.2 megabases and contains 49 annotated genes. Direct sequencing of coding exons and adjacent splice sites of all genes within the linked region identified a homozygous, not yet annotated missense variation in the PNPT1 gene in the affected individuals. The substitution of guanine for adenine at nucleotide position 1424 (c.1424A>G) in PNPT1 led to an amino acid change from glutamic acid to glycine (p.E475G). This alteration could be found neither in 400 healthy control individuals nor in the database dbSNP nor in the Exome Variant Server, making it unlikely that it represents a common polymorphism. Polynucleotide phosphorylase (PNPase), encoded by PNPT1, is an evolutionarily highly conserved protein, which is known to be involved in RNA turnover in bacteria. In mammals, PNPase localizes to the mitochondrial intermembrane space and is so far the only known protein that mediates the import of RNAs into mitochondria - a process that is required for the replication and the transcription of the mitochondrial genome. The coding sequence of the PNPT1 ortholog in zebrafish, which to date is not annotated, was identified and cloned completely. Using in situ hybridization the expression of PNPT1 in early developmental stages of the zebrafish could be determined. Similar to the embryonic lethality of the already described PNPT1-knockout-mouse, morpholino-mediated knockdown of PNPT1 in zebrafish led to severe malformations in early zebrafish development, showing that PNPase function is essential for both mouse and zebrafish. Immunohistochemistry of PNPase in the murine cochlea revealed PNPase expression in the affected organ including hair cells, as well as spiral and vestibular ganglion neurons. In vitro analysis in bacteria, yeast and mammalian cells illustrated that the E475G mutation represents a hypofunctional allele. Complementation studies in E. coli demonstrated that PNPase-deficient E. coli strains expressing bacterial PNPase with the corresponding amino acid substitution show significantly poorer growth under oxidative stress conditions than PNPase-deficient E. coli strains expressing bacterial wildtype-PNPase. Furthermore, in yeast and in mammalian cells the trimerization of PNPase as well as the mitochondrial RNA import of RNase P RNA is impaired by the E475G mutation. The impaired RNase P RNA import probably leads to a compromised processing of mitochondrial transcripts by RNase P and may thus result in an accumulation of these transcripts in the mitochondrial matrix. Similar to mutations in mitochondrial genes known to cause hearing loss, the accumulation of such transcripts might be a possible explanation for the deafness in the family investigated here. In summary, it was shown for the first time that an impaired function of PNPase probably reducing mitochondrial RNA import leads to hereditary hearing loss in humans.

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