Structural and functional characterization of natural alleles of potato (Solanum tuberosum L.) starch phosphorylases associated with tuber quality traits

Nader Nieto, Anna Camila (2011). Structural and functional characterization of natural alleles of potato (Solanum tuberosum L.) starch phosphorylases associated with tuber quality traits. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

The enzymatic degradation of tuber starch and the subsequent accumulation of reducing sugars upon cold storage, also known as cold sweetening, are complex traits that negatively affect potato processing quality, constituting a challenge for breeding programs. In an effort to decipher the molecular basis of cold sweetening, a previous association mapping study identified DNA polymorphisms in functional genes of the carbohydrate metabolism, which were associated with tuber starch content and chip quality before and after cold storage. Two of the associated alleles encoded the plastidial starch phosphorylases Pho1a and Pho1b located on chromosomes III and V, respectively. The main objective of this research was to functionally characterize allelic variants of starch phosphorylase that possibly contribute to the variation of quality traits. Full length Pho1a cDNA’s were cloned from four tetraploid potato cultivars. The Pho1a-HA allele was identified, which represented the molecular markers associated with tuber quality traits. The association of Pho1a-HA was further confirmed in two additional populations, in which genotypes bearing the allele accumulated fewer reducing sugars during cold storage and had higher contents of starch. The Pho1a-HA allele was negatively associated with resistance to tuber bruising. Despite the presence of polymorphisms in areas of positive and negative regulation of the Pho1a promoter, the expression in tubers of the Pho1a-HA allele was constant during cold storage and corresponded to the allele dosage, showing that the allele is not subjected to transcriptional regulation. The presence of the PHO1a-HA isoform in protein extracts was confirmed by 2D-gel electrophoresis and mass spectrometry. This isoform contains six amino acid substitutions from which one has no precedents in all known glucan phosphorylases. Activity assays demonstrated that genotypes bearing the PHO1a-HA isoform in a duplex allele dosage had no detectable starch phosphorylase activity, suggesting that Pho1a-HA is an allele which compromises functional starch phosphorylase enzyme complexes. The negative effect of the novel substitutions in key regions for protein dimerization, shown by in silico mutagenesis in the crystal structure of the rabbit muscle glycogen phosphorylase, supports this hypothesis. The association of Pho1a-HA with quality traits in different populations and the detrimental effect of the allele on enzyme activity support the hypothesis that natural variants of the Pho1a gene contribute to the phenotypic variation in tuber quality traits and provides further insights into the understanding of sugar accumulation at low temperatures. Additionally, natural alleles of the Pho1b gene were identified. The large amount of SNPs limited the phasing and haplotype assembly. Non-synonymous SNPs however, allowed the clustering of the alleles which were assigned to the different SSCP polymorphisms associated with quality traits. The broad genetic diversity of potato cultivars and wild relatives offers a wealth of natural resources, which genetic potential can be exploited to improve agronomic performance. The PCR-based molecular markers developed in this work can be integrated by breeders in their selection programs.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

UNSPECIFIED

English

Der enzymatische Abbau von Stärke in Kartoffelknollen während der Lagerung bei niedrigen Temperaturen und die dadurch auftretende Zuckeranreicherung wird als „Cold Sweetening“ bezeichnet. Diese Eigenschaft, die von verschiedenen Genen beeinflusst wird, hat einen negativen Einfluss auf die industrielle Weiterverarbeitung und wird daher in Züchtungsprogrammen berücksichtigt. In einer zuvor durchgeführten Assoziationsstudie, um die molekularen Vorgänge während des „cold Sweetening“-Prozesses zu verstehen, wurden DNA Polymorphismen in Genen des Kohlenhydratmetabolismus identifiziert, und Assoziationen mit dem Stärkegehalt von Kartoffelknollen und der Verarbeitbarkeitsqualität vor und nach der Kühlhauslagerung gefunden. Zwei der assoziierten Allele kodieren für die Stärke-Phosphorylasen Pho1a und Pho1b, die auf den Chromosomen III und V lokalisiert sind. Das Ziel dieser Studie war die funktionelle Charakterisierung der Allelvarianten der Stärke-Phosphorylase und ihr Einfluss auf Qualitätsmerkmale. Eine Analyse von Pho1a cDNA-Sequenzen, die aus tetraploiden Kartoffelsorten isoliert wurden, führte zur Identifikation des Pho1a-HA-Allels, welches mit Qualitätsmerkmalen assoziiert ist. Diese Assoziation konnte in weiteren Populationen bestätigt werden, wobei Pflanzen die das Pho1a-HA-Allel trugen während der Kühlhauslagerung weniger Zuckeranreicherung zeigten und höhere Stärkekonzentrationen aufwiesen. Des Weiteren konnte ein negativer Zusammenhang mit der Resistenz gegenüber Schwarzfleckingkeit/Schlagschäden belegt werden. Obwohl Polymorphismen in Pho1a-Promotorbereichen gefunden wurden, zeigten Expressionsanalysen, dass das Pho1a-HA auch während der Kühllagerung im Vergleich zu anderen Allelen nicht transkriptionell reguliert wird. Die Anwesenheit der PHO1a-HA-Isoform in Proteinextrakten konnte durch 2D-Gelelektrophoreseanalysen und massensprektrometrisch bestätigt werden. Diese Isoform enthält sechs Amionsäuresubstitutionen, von denen eine in keiner bekannten Glucan-Phosphorylase auftritt. Untersuchungen der Phosphorylaseaktivität von verschiedenen Sorten zeigte, dass in Pflanzen mit zwei Pho1a-HA Allelen keine messbare Aktivität mehr festgestellt werden konnte, was darauf hindeutet, dass das Pho1a-HA-Allel einen negativen Einfluss auf die Funktionalität von Stärke-Phosphorylasekomplexen hat. Diese Hypothese wird durch in silico-Mutageneseanalysen an der Kristallstruktur der Kaninchenmuskel-Glycogen-Phosphorylase unterstützt, die zeigen, dass die Substitutionen in Pho1a-HA in Schlüsselregionen der Protein-Dimerisierung liegen. Die Assoziation von Pho1a-HA mit Qualitätsmerkmalen und der negative Effekt auf die Phosphorylaseaktivität befürworten die Hypothese, dass natürliche Varianten des Pho1a-Gens zur phänotypischen Vielfalt beitragen, und erweitern das Verständnis des Prozesses der Zuckeranreicherung bei niedrigen Temperaturen. Des Weiteren wurden natürliche Allele des Pho1b-Gens identifiziert. Die große Anzahl von SNPs behinderte hier die Identifizierung von Haplotypen. Allerdings konnten durch die Analyse nicht-synonymer SNPs Proteinsequenzen mehrerer Allele ermittelt werden, welche dann verschiedenen SSCP-Polymorphismen, die mit Qualitätsmerkmalen assoziiert sind, zugeordnet werden konnten. Die ausgeprägte genetische Vielfalt von Kartoffelsorten und Wildformen bietet eine Fülle von Ressourcen, deren genetisches Potential zur Verbesserung der landwirtschaftlichen Leistungsfähigkeit genutzt werden kann. Die PCR-basierten molekularen Marker, die im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurden, können in Zuchtprogrammen eingesetzt werden.

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