Universität zu Köln

Brüggemann, Sabrina (2012). Generation of an oncolytic adenovirus vector combining three cancer targeting strategies and characterization of a new preclinical model for breast cancer virotherapy. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Breast cancer is still one of the most frequently diagnosed cancer types in women. Although a variety of treatment options and early detection methods are now available, breast cancer remains one of the leading causes of cancer death among women. Therefore, new therapy approaches are sorely needed. Virotherapy employing oncolytic adenoviruses (Ads) represents a promising tool for treating a wide array of neoplastic diseases including breast cancer. Critical for an effective therapeutic index is selective killing of breast cancer cells while avoiding killing normal cells. Besides the generation of cancer specific oncolytic vectors, new animal models which are immunocompetent and permissive for adenovirus replication are desperately needed to evaluate oncolytic Ad vector functions in a preclinical model. Herein, a novel oncolytic Ad was constructed to target breast cancer by incorporating three cancer control elements into the Ad5 genome: 1) transductional, 2) transcriptional and 3) mRNA translational targeting. A modified triple-level targeted oncolytic Ad (Ad5/3 CXCR4 UTR) incorporating a serotype 5/3 chimeric fiber was generated. This construct used the human CXCR4 gene promoter and the 5’-untranslated region (UTR) from rat Fibroblast Growth Factor-2 mRNA to regulate Ad E1A gene transcription and translation. It was hypothesized that this novel vector would improve the therapeutic index by selective targeting of human breast cancer cells. While it was achieved to construct a replication competent Ad5/3 CXCR4 UTR, this vector displayed a lower oncolytic activity in breast cancer cells compared to Ad5/3 WT and Ad5/3 CXCR4. Since multiple vector modifications could negatively influence virus replication, we examined their effects. We could detect no effects of Ad5/3 knob modification on eIF4E protein expression or on phosphorylation of 4E-BP, which are necessary for the translational targeting element. Furthermore, stable expression of E1A in MDA-MB-231 cells could not provide an increased oncolytic activity of Ad5/3 CXCR4 UTR to the level observed in HEK-293 cells. However, we could show that E1A transcription was delayed in Ad5/3 CXCR4 UTR infected MDA-MB-231 cells compared to the other viruses infected MDA-MB-231 cells. Thus, this may lead to the assumption that HEK-293 cells provide an unknown factor that is ameliorating the combination effect of transductional, transcriptional and mRNA translational targeting that limits oncolytic activity of Ad5/3 CXCR4 UTR. In the next step, our group succeeded in establishing two Syrian hamster breast cancer cell lines (HMAM4B and HMAM5) from N-methyl-N-nitrosurea (MNU)-induced mammary tumors of female Syrian hamsters. It could be demonstrated that these two cell lines maintained characteristic cancerous and tumorigenic features. Furthermore, these cell lines induced tumor formation in syngeneic female Syrian hamsters upon subcutaneous injection. Functional in vitro assays of oncolytic Ads on HMAM5 cells, demonstrated a specificity of oncolytic Ad replication and oncolysis in the HMAM5 cell line compared to normal Syrian hamster fibroblasts. These results showed that the HMAM5 cell line can be used to evaluate the breast cancer efficacy of oncolytic Ad vectors in an immunocompetent preclinical model.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Das Mammakarzinom ist immer noch der häufigste maligne Tumor der Frau weltweit. Obwohl es mittlerweile eine große Anzahl von Therapiemöglichkeiten und Methoden zur frühen Erkennung gibt, bleibt das Mammakarzinom eine der Haupttodesursachen unter Krebspatientinnen. Deswegen sind neue Therapieansätze dringend notwendig. Die Virotherapie stellt eine viel versprechende neue Therapieform für ein breites Spektrum von Krebserkrankungen inklusive Brustkrebs dar. Eine Art der Virotherapie setzt die so genannten onkolytischen Adenoviren (Ad) ein. Kritisch für einen effektiven therapeutischen Index ist das selektive Abtöten von Tumorzellen durch Ads bei gleichzeitiger Schonung von gesundem Gewebe. Neben der Generierung neuer onkolytischer Vektoren für tumorspezifische Zellzerstörung, ist die Entwicklung eines immunkompetenten und für Ad Replikation permissiven Tiermodells von großer Notwendigkeit, um onkolytische Vektoren präklinisch zu testen. In dieser Arbeit wurde erstmals ein onkolytisches Ad generiert, das spezifisch Mammakarzinomzellen zerstören soll, indem die drei folgenden Targeting Strategien in das adenovirale Genom inkorporiert wurden: 1) Transduktionales, 2) Transkriptionales und 3) Translationales Targeting. Das neu generierte onkolytische triple-level Ad (Ad5/3 CXCR4 UTR) beinhaltet einen serotypischen 5/3 chimären Fiber als transduktionales Targeting, den humanen CXCR4 Genpromoter als transkriptionales Targeting und die 5’UTR Sequenz des Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) der Ratte als translationales Targeting upstream des viralen E1A Genes. Dieser virale Vektor sollte durch ein gesteigertes selektives Targeting von Mammakarzinomzellen den therapeutischen Index erhöhen. Bedauerlicherweise wurde im Vergleich mit Ad5/3 WT und Ad5/3 CXCR4 eine geringere onkolytische Aktivität des replikationskompetenten Ad5/3 CXCR4 UTR in Brustkrebszellen festgestellt. Einen Einfluss der Bindung des Ad3 Fiber Knobs auf die eIF4E Protein Expression und die 4E-BP Phosphorylierung, welche wichtig für die Translationinitiation sind, konnte nicht festgestellt werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass die verringerte onkolytische Aktivität des Ad5/3 CXCR4 UTR auf eine verzögerte E1A Transkription zurückzuführen war. Die Annahme, dass ein Abbau der E1A mRNA durch die Ad3 Fiber Knob Bindung stattfindet, wurde in dieser Arbeit durch mRNA Stabilitätsanalysen widerlegt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass es trotz einer stabilen E1A Expression in MDA-MB-231 Zellen zu keiner erhöhten onkolytischen Aktivität des Ad5/3 CXCR4 UTR kommt, welche in HEK-293 Zellen erkennbar war. Aus diesem Grund ist anzunehmen, dass HEK-293 Zellen einen unbekannten Faktor exprimieren, der zu einer erhöhten onkolytischen Aktivität des Ad5/3 CXCR4 UTR führt. Im nächsten Schritt, konnte unsere Gruppe erfolgreich zwei Zelllinien (HMAM4B and HMAM5) aus N-methyl-N-nitrosurea (MNU)-induzierten Mammakarzinomen des weiblichen Goldhamsters isolieren. Die Eigenschaften von Krebszellen konnten in diesen Zelllinen erhalten werden und es konnte gezeigt werden, dass die HMAM4B und die HMAM5 Zelllinie immortalisiert sind. Außerdem konnten nach subkutaner Injektion dieser Zellen Mammakarzinome in genetisch identischen weiblichen Goldhamstern induziert werden. Funktionalitätsuntersuchungen in vitro von verschiedenen etablierten onkolytischen Ads in der HMAM5 Zelllinie zeigten, dass eine spezifische Vermehrung des Ad5 Δ24 RGD und Onkolyse in den HMAM5 Zellen stattfindet im Gegensatz zu normalen Goldhamster Fibroblasten. Die hier neu etablierte Goldhamster Mammakarzinomzelllinie HMAM5 kann somit zur Evaluierung von humanen onkolytischen Ad für das Mammakarzinom eingesetzt werden. Zukünftige in vivo Studien könnten zeigen, dass das neu generierte Mammakarzinom Modell des Goldhamsters als immunokompetenes Tiermodell eingesetzt werden kann, um onkolytische Ad Vektoren präklinisch zu testen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Brüggemann, Sabrina sabrina.brueggemann1@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Corporate Contributors:	ZMMK
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-48076
Date:	May 2012
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Virologie > Institut für Virologie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Adenovirus, Breast cancer, Virotherapy, Syrian Hamster English
Date of oral exam:	11 July 2012
Referee:	Name Academic Title Knebel-Mörsdorf, Dagmar Prof. Dr. Büning, Hildegard PD Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4807