Universität zu Köln

Alejandre Alcázar, Miguel Angel (2012). Inflammatory Response as a Mechanism of Perinatal Programming: Long-term Impact on Pulmonary and Renal Function? PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

RATIONALE: Temporal changes in the fetal environment, such as malnutrition and placental insufficiency induce intrauterine growth restriction (IUGR) and lead to a permanent changes of physiological processes later in life. Interestingly, epidemiological studies demonstrated an impairment of lung and renal function in young infants subsequent to IUGR. Complementary, experimental studies showed that IUGR induces a perinatal programming of the developing lung with persisting impairment of pulmonary structure and function. Besides IUGR, early postnatal hyperalimentation (pHA) is discussed as a crucial factor of IUGR-associated diseases. Both extracellular matrix (ECM) and inflammatory processes have been shown to be dysregulated following IUGR and early pHA. However, the underlying molecular mechanisms of IUGR-associated diseases and the potential linkage of ECM and inflammation have not been addressed so far. Therefore, the ultimate goal of this project was to elucidate the role of regulation of ECM and inflammatory cytokines subsequent to IUGR and early pHA. AIMS: There are three specific aims: (1) to analyze the role of the TGF-β signaling in lung development subsequent to IUGR, (2) to determine the regulation of inflammatory cytokines and ECM-molecules in lungs subsequent to IUGR, and (3) to characterize the pathomechanistic role of early pHA using the example of the kidney. METHODS: Two simultaneous sets of animal experiments were used. One animal model addressed pre- and postnatal nutritional intervention, the other was restricted to postnatal interventions only: (A) IUGR was induced in Wister rats by isocaloric low protein diet (8% casein; IUGR) during gestation. The control group received normal protein diet (17% casein; Co). At birth the litter size was reduced to 6 male pups to induce early pHA. During lactation the mothers of both groups were fed standard chow. (B) Early pHA was induced by litter size reduction to 6 (LSR6) or 10 (LSR10) male neonates. Home-cage control (HCC; mean litter size of 16) animals without any postnatal manipulation during lactation were included. At postnatal day (P) 28 as well as P70 animals underwent whole body plethysmography and in addition metabolic cages at P70. Serum and samples of lungs and kidney were obtained at P1, P12, P21, P42, and P70 for mRNA extraction, protein extraction as well as histological analyses. RESULTS: Both respiratory system resistance and compliance were impaired subsequent to IUGR at P28; this impairment was even more significant at P70. (1) These changes were accompanied by persistent attenuated activity of the TGF-β signaling, assessed by phosphorylation of Smad2 and Smad3. Expression analysis of TGF-β-regulated ECM components in the lungs of IUGR animals at P1, such as collagen I, elastin, and tenascin N, revealed a significant deregulation. Consistently, in vitro inhibition of TGF-β signaling in NIH/3T3, MLE 12 and endothelial cells by adenovirus-delivered Smad7 demonstrated a direct effect on the expression of ECM components. Interestingly, however, not just a deregulation of ECM components was detected at P1, but also attenuated apoptotic processes, e.g. decreased cleavage of PARP. (2) Since the TGF-β signaling has potent anti-inflammatory effects, we next determined the dynamic expression of pro-inflammatory and pro-fibrotic markers as well of ECM components in the lung subsequent to IUGR at P1, P42 and P70. The expression of ECM components and metabolizing enzymes was markedly deregulated and the deposition of collagen I was strikingly increased at P70. Concomitantly to the pro-fibrotic processes in the lung subsequent to IUGR, the expression of inflammatory cytokines and both the activity and the expression of target genes of Stat3 signaling were dynamically regulated, with unaltered or decreased expression at P1 and significantly increased expression art P70. (3) Assessment of renal function at postnatal day 70 revealed decreased glomerular filtration rate, proteinuria, and increased fractional sodium and potassium secretion following early pHA (LSR6). Moreover, the deposition of ECM molecules, such as collagen I, was increased. Interestingly, despite the elevated expression of pro-inflammatory leptin and IL-6 expression the phosphorylation of Stat3 and ERK1/2 in the kidney, however, was decreased after LSR6. In accordance, neuropeptide Y (NPY) gene expression – sympathetic co-neurotransmitter regulated by Stat3 signaling – was down-regulated. In accordance, suppressor of cytokine signaling (SOCS)3 protein expression, an inhibitor of Stat3 and Erk1/2 signaling, was strongly elevated and colocalized with NPY. Interestingly, NPY is co- localized with SOCS3 in the distal tubules in the cortex and outer medulla, and in the proximal tubules, but no expression of SOCS3 was detectable in glomeruli. CONCLUSION: Taken together, IUGR has a direct and strong negative impact on respiratory resistance and compliance of the lung. There are two major underlying mechanisms linking IUGR and deregulation of ECM: first, the attenuated TGF-β signaling during late lung development; and second, the increased expression of inflammatory cytokines subsequent to IUGR. In addition, the missing anti-inflammatory effect of TGF-β signaling could contribute to the increased inflammatory response following IUGR. Furthermore we demonstrated that early pHA leads to organ-intrinsic increased expression of NPY via a postreceptor-leptin-receptor leptin resistance. This leptin resistance could contribute to the observed profibrotic processes, and ultimately to a long-term impairment of renal function. Thus, both IUGR and early postnatal hyperalimentation have a strong impact on perinatal programming of multi-organ inflammatory response.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language HINTERGRUND: Kurzzeitige intrauterine Einlüsse, wie maternale Unterernährung oder Plazentainsuffizienz führen zu einer intrauterinen Wachstumsrestriktion (IUGR) und letztlich zu dauerhaften Veränderungen physiologischer Prozesse. Epidemiologische Studien zeigen sowohl renale als auch pulmonale Funktionsstörungen in Kindern nach IUGR. Ergänzende experimentelle Arbeiten konnten zudem perinatale Programmierung persistierender struktureller Veränderungen in Lunge und Niere nach IUGR aufweisen. Neben der IUGR selbst wird die frühe postnatale Hyperalimentation (pHA) als zentraler Faktor der IUGR-assoziierten Erkrankungen diskutiert. Es ist zudem gezeigt worden, dass sowohl die extrazellulären Matrix (ECM) als auch inflammatorische Prozesse nach IUGR und früher pHA dysreguliert sind. Dennoch sind die zugrunde liegenden Mechanismen der IUGR-assoziierten Erkrankungen sowie der potentielle Zusammenhang zwischen Veränderungen der ECM und inflammatorischen Prozessen noch weitgehend ungeklärt. Aus diesem Grunde war das zentrale Ziel dieser Studie, die Rolle der Regulation der ECM und inflammatorischer Zytokine nach IUGR und früher pHA zu untersuchen. ZIELE: Drei spezifische Ziele sollten an Rattenmodellen verfolgt werden: (1) Analyse der Rolle der TGF-β Signalkaskade in der Lungenentwicklung nach IUGR, (2) Untersuchung der Regulation inflammatorischer Zytokine sowie der ECM-Moleküle nach IUGR, und (3) Charakterisierung der pathomechanistischen Bedeutung früher pHA am Beispiel der Niere. METHODS: Zwei parallele unabhängige Tierexperimente wurden genutzt Das erste Tiermodel umfasst prä- und postnatale, das zweite hingegen nur postnatale nutritive Intervention: (A) IUGR wurde in Wistar Ratten induziert durch isokalorische Proteinmangeldiät (8% Casein; IUGR) während der Gestation. Die Kontrollgruppe erhielt Normalproteindiät (17% Casein, Co). An der Geburt wurden die Würfe auf sechs männliche Nachkommen reduziert, um eine frühe pHA zu induzieren. In der Laktationsphase wurde den Muttertieren Standardfutter gefüttert. (B) Frühe pHA wurde durch Wurfreduktion auf 6 (LSR6) beziehungsweise 10 (LSR10) männliche Neonaten induziert. Eine zusätzliche Gruppe ohne Wurfreduktion (HCC; mittlere Wurfgröße 16) wurde ergänzt. Am postnatalen Tag (P) 28 und am P70 wurden Ganzkörperplethysmography sowie metabolischen Untersuchungen in metabolischen Käfigen am P70 durchgeführt. Serum sowie Lungen- und Nierenproben wurden am P1, P12, P21, P42 und P70 für mRNA Extraktion, Proteinextraktion sowie histologische Untersuchungen gewonnen. ERGEBNISSE: Sowohl der Atemwegswiderstand als auch die dynamische Compliance waren eingeschränkt nach IUGR am P28. Diese pulmonale Funktionsstörung war am P70 sogar noch ausgeprägter. (1) Die funktionellen Veränderungen der Lunge waren begleitet von einer persistierend erniedrigten Aktivität der TGF-β Signalkaskade mit verminderter Phosphorylierung von Smad2 und Smad3. Dementsprechend wies die Genexpressionsanalyse TGF-β-regulierter ECM Komponenten, wie Collagen I, Elastin und Tenascin N, eine signifikante Dysregulation auf. Im Einklang mit diesen in vivo Daten, führte die in vitro Inhibition der TGF-β Signalkaskade in NIH/3T3, MLE-12 und Endothelzellen durch adenovirale Überexpression von Smad7 zu den entsprechenden Expressionsveränderungen der ECM Komponenten. Interessanterweise waren am P1 auch apoptotische Prozesse nach IUGR gehemmt. (2) Da TGF-β auch starke anti-inflammatorische Wirkung besitzt, haben wir als nächstes die Expression pro-inflammatorischer und -fibrotischer Marker sowie von ECM Komponenten in der Lunge nach IUGR am P1, P42 und P70 untersucht. Die Expression der ECM-Komponenten und der metabolisierenden Enzyme war deutlich alteriert und zudem die Ablagerung von Collagen I am P70 beachtlich erhöht. Begleitend zu diesen pro-fibrotischen Veränderungen war die Expression inflammatorischer Zytokine und die Aktivität der Stat3 Signalkaskade mit einer signifikanten Steigerung an P70 reguliert. (3) Die Analyse der Nierenfunktion am P70 zeigte eine erniedrigte glomeruläre Filtrationsrate, Proteinurie, erhöhte fraktionelle Natrium- sowie Kaliumsekretion nach früher pHA (LSR6). Strukturell zeigte sich eine gesteigerte Ablagerung von Collagen I in der Niere. Interessanterweise, war trotz der starken Expression des pro-inflammatorischen Leptins und des Interleukin 6 (IL-6) die Phosphorylierung von Stat3 und Erk1/2 in der Niere erniedrigt nach früher pHA. Entsprechend der erniedrigten Aktivität der Stat3 Signalkaskade war die Genexpression von Neuropeptid Y (NPY) – ein von Stat3-regulierter sympathischer Co-Neurotransmitter – erniedrigt. Die Proteinexpression von suppressor of cytokine signaling (SOCS)3 – ein Inhibitor des Stat3 und Erk1/2 Signalweges – war deutlich erhöht. Bemerkenswert ist zudem, dass NPY mit SOCS3 im distalen Tubulus der Nierenrinde und des -marks co-lokalisiert ist, aber SOCS3 nicht im Glomerulus detektierbar war. SCHLUSSFOLGERUNG: Diese Studie zeigt, dass IUGR einen direkten negativen Einfluss auf den Atemwegswiderstand und die dynamische Compliance der Lunge hat. Zwei zentrale zugrunde liegende Mechanismen wurden aufgewiesen: erstens, die erniedrigte Aktivität der TGF-β Signalkaskade während der späten Lungenentwicklung und zweitens, eine gesteigerte Expression inflammatorischer Zytokine. Zusätzlich kann die fehlende anti-inflammatorische Wirkung von TGF-β nach IUGR zu der erhöhten inflammatorischen Reaktion nach IUGR beitragen. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass die frühe pHA zu einer organspezifischen gesteigerten Expression von NPY über eine postrezeptor-Leptinrezeptor Leptinresistenz führt. Diese Leptinresistenz könnte zu den bebachteten pro-fibrotischen Prozessen und letztlich zu den renalen Langzeitfolgen nach früher pHA beitragen. Zusammenfassend kann man sagen, dass sowohl IUGR als auch frühe pHA eine tragende Rolle in der perinatalen Programmierung inflammatorischer Prozesse haben. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Alejandre Alcázar, Miguel Angel miguel.alejandre-alcazar@uk-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Corporate Contributors:	ZMMK
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-48207
Date:	2012
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Ehemalige Fakultäten, Institute, Seminare > Faculty of Mathematics and Natural Sciences > no entry
Subjects:	Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language lung development UNSPECIFIED intrauterine growth restriction UNSPECIFIED perinatal programming UNSPECIFIED renal development UNSPECIFIED inflammatory response UNSPECIFIED
Date of oral exam:	5 July 2012
Referee:	Name Academic Title Benzing, Thomas Prof. Dr. Hammerschmidt, Matthias Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4820