Universität zu Köln

Berlepsch, Simon Hans Arnfrid Sittich Freiherr von (2012). Charakterisierung der vektoriellen Acylierung als Mechanismus des Fettsäuretransports in Synechocystis sp. PCC 6803. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Transfer of fatty acids across biological membranes is a largely uncharacterized process. In unicellular organisms, like Escherichia coli or Saccharomyces cerevisiae vectorial acylation by acyl-activating enzymes is discussed as mechanism for fatty acid transport. In the present work, studies on the only acyl-acyl-carrier protein synthetase SynAas of Synechocystis sp. PCC 6803 with regard to fatty acid transport were performed. Cells deficient in SynAas were highly resistant to externally provided α-linolenic acid. Upon treatment with external α-linolenic acid the wild type showed continuous accumulation of α-linolenic acid in cellular lipids and as free fatty acid in the cell. Long-term incubation with α-linolenic acid for 10 hours led to structural changes in the integrity of thylakoid membranes and a dramatic increase in electron transport rate (ETR) in wild type cells. After 24 hours of incubation the accumulation resulted in bleaching and dying of the wild type cells, whereas the loss of function mutant ∆synaas was completely unaffected by this treatment. Furthermore, Saccharomyces cerevisiae wild type cells displayed sensitivity against α-linolenic acid, whereas the “loss of function” mutant in the fatty acid importer FAT1p showed resistance upon α-linolenic acid incubation. Heterologous expression of SynAas in yeast wild type and ∆fat1 mutant cells resulted in an increased sensitivity against exogenous α-linolenic acid, which implies elevated levels of uptake of toxic α-linolenic acid through SynAas. In addition, liposome assays provided direct evidence for the ability of purified SynAas protein to mediate [14C]-α-linolenic acid retrieval from preloaded liposome membranes. Taken together, the data show that the acyl-activating enzyme SynAas is necessary and sufficient to mediate transfer of fatty acids across a biological membrane. These facts were used to derive a model for α-linolenic acid uptake and metabolism in Synechocystis. In addition, the ABC- Transporter SynAbc could be identified as putative fatty acid exporter. The SynAbc “loss-of-function” mutant ∆synabc exhibited increased sensitivity upon α-linolenic acid treatment and massive accumulation of exogenously applied fatty acid, compared to wild type. The ∆synaas mutant secreted free fatty acids into the media. A simultaneous defect in the SynAbc gene completely prevented accumulation of fatty acids in the media, which gives rise to the assumption that SynAbc facilitates fatty acid export in Synechocystis.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Fettsäuretransport über biologische Membranen ist ein weitgehend uncharakterisierter Prozess. In einzelligen Organismen wie Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae wird der Mechanismus der vektoriellen Acylierung durch Acyl-aktivierende Enzyme als Transportmechanismus für freie Fettsäuren diskutiert. In dieser Arbeit wurde die einzige Acyl-Acyl Carrier Protein Synthetase (SynAas) im einzellige Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 in Bezug auf Fettsäuretransport untersucht. Interessanterweise zeigte eine Funktionsverlust- mutante im SynAas Enzym in Synechocystis eine hochgradige Resistenz gegen hohe Konzentrationen α-Linolensäure. Der Wildtyp hingegen zeigte eine starke Anreicherung an α-Linolensäure in den Lipiden und als freie Fettsäure in der Zelle. Zusätzlich offenbarten sich nach 10 Stunden strukturelle Veränderungen der Thylakoidmembran und eine deutliche Verringerung der Elektronentransportrate. Nach 24 Stunden kam es zum kompletten Ausbleichen und Absterben der Wildtyp Zellen. Diese Effekte der α-Linolensäure blieben bei der ∆synaas Mutante aus, was darauf schließen lässt, dass eine Aufnahme der toxischen Fettsäure durch den Funktionsverlust von SynAas verhindert wird. Saccharomyces cerevisiae Wildtyp Zellen zeigten ebenfalls reduziertes Wachstum auf erhöhten α-Linolensäure Konzentrationen, während der Funktionsverlust des charakterisierten Fettsäuretransporters FAT1p α-Linolensäure resistentes Wachstum zeigte. Durch die Überexpression des SynAas Enzyms im Hefe Wildtyp und der ∆fat1 Mutante, konnte eine erhöhte Sensitivität gegenüber α-Linolensäure erreicht werden, was für eine zusätzliche Aufnahme der toxischen Fettsäure in die Hefezelle durch SynAas spricht. In einem neuentwickelten Liposomenassay konnte gezeigt werden, dass SynAas in Membranen eingebundene Fettsäuren als Substrat nutzen kann. Fasst man die Ergebnisse zusammen, so zeigt sich, dass das Acyl-aktivierende Enzym SynAas, Fettsäureimport durch vektorielle Acylierung vermitteln kann. Aus den erhaltenen Daten wurde ein Modell entwickelt, das die Aufnahme und den weiteren Metabolismus von α-Linolensäure in Synechocystis beschreibt. Weiterhin konnte im ABC-Transporter SynAbc ein putativer Fettsäureexporter in Synechocystis gefunden werden. Die ∆synabc Funktionsverlust Mutanten zeigte erhöhte Sensitivität gegenüber α-Linolensäure und akkumulierte große Mengen an exogen aufgenommener Fettsäure im Vergleich zum Wildtyp. Die ∆synaas Mutante sekretiert freie Fettsäuren ins Außenmedium. Diese Sekretion konnte durch einen zusätzlichen Defekt des SynAbc Gens verhindert werden, was Grund für die Annahme ist, dass SynAbc Fettsäureexport in Synechocystis vermittelt. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Berlepsch, Simon Hans Arnfrid Sittich Freiherr von berlepsch@mpipz.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-48224
Date:	16 March 2012
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Botanical Institute
Subjects:	Psychology
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Fettsäuretransport, Synechocystis, Acyl-ACP Synthetase German
Date of oral exam:	7 May 2012
Referee:	Name Academic Title Flügge, Ulf-Ingo Prof. Dr. Waffenschmidt, Sabine Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4822