Universität zu Köln

Acevedo Garcia, Johanna (2012). Chromosome walking towards the Ror1 (Required for mlo resistance 1) locus in barley (Hordeum vulgare L.). PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The presence of the seven-transmembrane (7-TM) domain Mlo (mildew resistance locus o) protein is a prerequisite for successful colonization of barley (Hordeum vulgare L.) by the biotrophic powdery mildew fungus, Blumeria graminis f.sp. hordei (Bgh). The mlo-mediated resistance response is dependent on at least two genes, Ror1 and Ror2 (required for mlo resistance). Double mutant mlo ror1 partially restores susceptibility to the fungus and exhibits reduced spontaneous leaf cell death. The Ror1 gene represents an interesting target for characterization, since its isolation could reveal an unknown pathway or additional molecular components necessary for effective mlo resistance. Nevertheless, despite extensive prior efforts to clone the Ror1 gene, its nature remains unknown. In this project, we pursued an alternative approach to isolate the Ror1 gene performing chromosome walking using a barley YAC library combined with Next Generation Sequencing (NGS) techniques. Previously, the Ror1 gene was located on barley chromosome 1H to an interval of 0.15cM between two predicted flanking genes, Cons and Pol. These two genes were used to design primers to screen a barley YAC library by PCR. The isolated YAC clones and additional overlapping ones, discovered by chromosome walking, formed the basis of our YAC contig at the Ror1 region. The YAC clones were paired-end sequenced by Illumina. Thorough analysis of the sequences revealed that we obtained two non-overlapping YAC contigs around the Ror1 locus. Eight annotated genes present in the contigs were selected as candidate genes. However, by “pseudo-mapping” in a Ror1 recombinant population and positioning in the YAC contigs, seven of the eight genes were excluded to encode Ror1. Furthermore, comparative genomics of barley with three other model grasses, Oryza sativa, Brachypodium distachyon and Sorghum bicolor revealed re-arrangements in the Ror1 region. Additionally, for the first time, we could physically locate the Ror1 region on barley chromosome 1H using Fluorescence In Situ Hybridization. Further chromosome walking steps are required to bridge the gap between Pol and Cons and complete the Ror1 YAC contig. The analysis of newly isolated YAC clones/pools that can be used to extend the YAC contigs is currently in progress. Our approach combining classical genetics and second-generation sequencing technologies has opened a new door that can potentially lead to the isolation of the Ror1 gene.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Gegenwart des sieben Transmembrandomänen Proteins Mlo (mildew resistance locus o) ist Vorraussetzung für eine erfolgreiche Kolonialisierung von Gerste (Hordeum vulgare L.) durch den biotrophen Mehltaupilz Blumeria graminis f. sp. hordei (Bgh). Die mlo-vermittelte Mehltauresistenz hängt dabei von mindestens zwei Genen ab, Ror1 und Ror2 (required for mlo resistance). Die Doppelmutante mlo ror1 ist wieder partiell anfällig gegenüber dem Mehltaupilz und weist verminderten spontanen Blattzelltod auf. Die Isolierung und Charakterisierung des Ror1 Gens ist von großer Bedeutung, weil dadurch bisher unbekannte Prozesse sowie neue molekulare Komponenten enthüllt werden könnten, welche für eine effektive mlo Resistenz erforderlich sind. Trotz extensiver Bemühungen, das Ror1 Gen zu klonieren, ist die Natur des Gens bis heute unbekannt. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit ein alternativer Ansatz zur Isolierung von Ror1 gewählt, bei dem ‚chromosome walking’ einer genomischen YAC-Bibliothek aus Gerste mit Hilfe der Next Generation Sequenzierung (NGS) durchgeführt wurde. Es wurde zuvor gezeigt, dass das Ror1 Gen auf dem Chromosom 1H in einem Intervall von ~ 0.15 cM zwischen den flankierenden Genen Cons und Pol lokalisiert ist. Mit Hilfe dieser beiden Gene wurden Oligonukleotide hergestellt, um die Gerste YAC-Bibliothek mittels PCR zu analysieren. Die dabei isolierten YAC-Klone sowie weitere überlappende Klone, die mittels ‚chromosome walking’ identifiziert wurden, formten dabei die Basis für das YAC-Kontig um den Ror1 Lokus. Die YAC-Klone wurden anschließend mit der ‚paired-end’ Methode der Illumina-Technologie sequenziert. Ausführliche Sequenzanalysen ergaben die Identifizierung von zwei nicht-überlappenden YAC-Kontigs in der Nähe der Ror1 Region, sowie acht annotierten Genen, die als Ror1 Genkandidaten in Frage kamen. Sieben dieser Kandidaten wurden jedoch mittels ‚pseudo-mappings’ einer rekombinanten Ror1 Population sowie ihrer Positionierung in den YAC-Kontigs als putatives Ror1 Gen ausgeschlossen. Zudem konnte mit Hilfe komparativer Genomanalysen von Gerste mit den drei Modellpflanzen Oryza sativa, Brachypodium distachyon und Sorghum bicolor eine Umorganisierung der Ror1 Region festgestellt werden. Des Weiteren haben wir mittels der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zum ersten Mal die physikalische Lokalisation der Ror1 Region auf dem Gerste Chromosom 1H bestätigt. Dennoch ist weiteres ‚chromosome walking’ notwendig, um die Lücke zwischen den flankierenden Genen Pol und Cons zu schließen und das vollständige Ror1 YAC-Kontig zu erhalten. Dazu wird die Analyse neu isolierter YAC-Klone zurzeit weiter verfolgt. In der vorliegenden Arbeit haben wir gezeigt, dass der Ansatz klassische Genetik mit den Sequenziertechnologien der zweiten Generation zu kombinieren, neue Wege zur Isolierung des Ror1 Gens eröffnet. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Acevedo Garcia, Johanna acevedo@mpipz.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-48605
Date:	3 October 2012
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Barley English Powdery Mildew English Ror1 gene English
Date of oral exam:	23 January 2012
Referee:	Name Academic Title Schulze-Lefert, Paul Prof. Dr. Flügge, Ulf-Ingo Prof. Dr. Schweizer, Patrick Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4860