Universität zu Köln

Mao, Qian (2012). Cellular signalling of adrenomedullin regulating endothelial barrier function and granulocyte extravasation. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Background: Disturbed endothelial barrier function is a hallmark of inflammation. Effusion of protein rich plasma fluid leading to edema formation and overshooting transmigration of leukocytes contribute to severe organ dysfunction under conditions of generalized inflammation, e.g. acute lung injury and sepsis. The peptide hormone Adrenomedullin (ADM) and its receptor (CRLR/RAMP2/3) constitute an important signaling system for the protection of endothelial barrier function. Although elevation of cAMP in endothelial cells was identified as signaling pathway of ADM responsible for barrier protection, it was speculated that other mechanisms are involved and precise intracellular signaling routes have not been explored, yet. Main findings and conclusions: ADM was confirmed to be a strong stabilizer of the endothelial barrier function in vitro, preventing and reversing hyperpermeability independent of the inflammatory stimulus (as determined by electrical impedance and FITC-dextran permeability measurements after stimulation with thrombin, TNFα, histamine, VEGF). Moreover, it was shown for the first time that ADM inhibited TNFα-induced granulocyte transmigration which was solely due to effects of ADM on endothelial cells. These in vitro-findings could be translated to animal models of vascular permeability and inflammation: ADM dose-dependently reduced vascular permeability in the skin of mice and rats (Miles assay; stimulus histamine). In a murine lipopolysaccharide (LPS)-induced lung injury model, ADM reduced lung edema and leukocyte extravasation. In endothelial cells, barrier protection could solely be reduced to cAMP signaling via the protein kinase A (PKA) and Epac-Rap1 pathways (dose response comparison with Forskolin). Dissection of the downstream cascade by means of cAMP analogs, specific for PKA and Epac-Rap1 signaling (benz-cAMP and “007”, respectively), demonstrated that both pathways are with respect to their efficacy equally involved in effects on permeability probably addressing independent effector mechanisms as suggested by enhanced efficacy of combination of both. Consistently, both pathway activators prevented vascular hyper-permeability in vivo. PKA activation and inhibition of MLC phosphorylation downstream of ADM diminish stimulus induced actin stressfiber formation and contraction of endothelial cells thus counteracting intercellular gap formation and hyperpermeability. Most notably, also effects independent of the contractile apparatus were demonstrated: ADM stabilized barrier function even in the absence of a functional actin cytosceletton after treatment with Cytochalasin D and knockdown of cortactin. ADM induced stabilization of VE-cadherin at the cell borders and increased the amount of detectable VE-cadherin/VE-PTP complex which is important for the regular function of VE-cadherin. In contrast, granulocyte transmigration was only reduced by PKA activation and ADM effects were lost after knockdown of cortactin. In line with this finding, a PKA inhibitor abolished the effect of ADM. As PKA activation reduces myosin light chain phosphorylation these data collectively link leukocyte extravasation to the contractile apparatus of the endothelial cell. As “007” was fully active with respect to TNFα induced hyperpermeability but had no effect with respect to granulocyte transmigration, endothelial hyperpermeability per se is not a prerequisite for granulocyte transmigration.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Hintergrund: Die Störung der endothelialen Schrankenfunktion ist ein Haupkennzeichen der Entzündung: Die Bildung von Ödemen durch den Austritt Protein-reicher Plasamaflüssigkeit und überschießende Auswanderung weißer Blutzellen ins Gewebe tragen zu schwerer Organfehlfunktion bei generalisierten Entzündungszuständen bei, wie z.B. im akuten Lungenversagen und der Sepsis. Das Peptidhormon Adrenomedullin (ADM) und sein Rezeptor (CRLR/RAMP2/3) stellen ein wichtiges Singalsystem dar, das die endotheliale Schrankenfunktion stabilisiert. Einer Erhöhung des cAMP-Spiegels wurde hierfür als Signalweg von ADM in Endothelzellen identifiziert. Daneben wurde aber auch die Existenz andere Mechanismen vermutet. Bislang sind die intrazellulären Signalwege von ADM in der endothelialen Schrankenfunktion noch nicht präzise untersucht worden. Hauptbefunde und Schlußfolgerungen: Es konnte bestätigt werden, dass ADM in vitro als starker Stabilisator der endothelialen Schrankenfunktion wirkt, indem es unabhängig vom verwendeten Entzündungsstimulus Hyperpemeabilität verhindert bzw. aufhebt (detektiert als elektrische Impedanz und Permeabilität für FITC-Dextran nach Stimulation mit Thrombin, TNFα, Histamin und VEGF). Darüber hinaus konnte erstmals gezeigt werden, dass ADM auch die durch TNFα-induzierte Transmigration von Granulozyten verhindert – ein Effekt der ausschließlich durch Wirkung von ADM auf das Endothel zustande kommt. Diese In vitro-Ergebnisse konnten auch in Tiermodellen für vaskuläre Permeabilität und Entzündung abgebildet werden. Mit ADM vorbehandelte Mäuse und Ratten zeigten dosisabhängig eine reduzierte Gefäßpermeabilität in der Haut (Miles-Assay mit Histamin als Stimulus). Darüber hinaus konnte eine Verringerung der Ödembildung und der Rekrutierung neutrophiler Granolozyten in der Lunge in einem murinen Lipopolysaccharid (LPS)-induzierten Lungenschädigungs-Modell gezeigt werden. In Endothelzellen konnte der die Schrankenfunktion steigernde Effekt von ADM ausschließlich auf den cAMP-Signalweg zurückgeführt werden, und gezeigt werden, dass sowohl der Protein-Kinase A als auch der Epac/Rap1 Signalweg aktiviert werden (Dosis-Wirkungs-Vergleich mit Forskolin). Mit Hilfe von cAMP-Analoga die spezifische Aktivatoren der Proteinkinase A (PKA) bzw. Epac/Rap1-Signalwege sind (benz-cAMP bzw. “007”) wurde die funktionelle Bedeutung der Signalwege analysiert. Die maximalen Effekte beider Signalwege in der Regulation der endothelialen Permeabilität sind zwar vergleichbar stark, laufen aber wahrscheinlich über unterschiedliche Effektormechanismen ab, da die Kombination beider Wege zur Verstärkung führt. Übereinstimmend mit dem in vitro-Befund verhinderten beide cAMP-Analoga die Gefäß-Hyperpermeabilität in vivo. Durch Aktivierung des PKA Signalweges und Hemmung der MLC Phosphorylierung reduziert ADM die Stimulus-induzierte Bildung von Aktin Stressfibers und die Kontraktion von Endothelzellen und wirkt so der Bildung interzellulärer Lücken und der daraus folgenden Hyperpermeabilität entgegen. Bemerkenswerter Weise konnten auch Effekte, die unabhängig vom kontraktilen Apparat waren, gezeigt werden: ADM stabilisiert die Schrankenfunktion sogar in der Abwesenheit eines funktionellen Aktin-Cytoskeletts nach Behandlung mit Cytochalasin D und Knockdown von Cortactin. ADM induziert die Stabilisierung von VE-Cadherin an den Zell-Zell Kontakten und die Menge des nachweisbaren VE-cadherin/VE-PTP Komplexes, der wesentlich für die korrekte Funktion von VE-Cadherin ist. Im Gegensatz dazu wurde die Granulozytentransmigration nur durch die PKA-Aktivierung gehemmt – ein Effekt der nach Knockdown von Cortactin aufgehoben war. Im Einklang mit diesem Befund hebt die Inhibition von PKA die Wirkung von ADM auf die Granulozytentransmigration auf. Da PKA-Aktivierung die Phosphorylierung der MLC hemmt, wird durch diese Befunde insgesamt die Abhängigkeit der Granulozytentransmigration vom kontraktilen Apparat der Endothelzelle deutlich. Da andererseits “007” die gestörte Schrankenfunktion aufhebt aber keinen Effekt auf die Transmigartion ausübt, ist eine gestörte Schrankenfunktion an sich (Hyperpermeabilitä) keine Voraussetzung für die Granulozytentransmigration. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Mao, Qian mao.qian@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-49099
Date:	11 November 2012
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Zoologisches Institut
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language adrenomedullin; cAMP; VE-cadherin; VE-PTP; Cortactin; endothelial permeability; granulocyte extravasation; English
Date of oral exam:	19 October 2012
Referee:	Name Academic Title Büschges, Ansgar Dr. rer. nat Herzig, Stefan Dr. med. Flamme, Ingo Dr. med.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4909