Universität zu Köln

Talloji, Prabhavathi (2011). Identification of novel components and links in ubiquitin dependent protein degradation pathways of Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The canonical ubiquitin 26S proteosome dependent protein degradation pathway and its sub-branch N-end rule pathway are important ubiquitin dependent processes in eukaryotes. The majority of substrates are predominantly targeted for degradation by the proteosome. Expression of a ubiquitin variant with Arg instead of Lys at position 48 (ubK48R) in the Arabidopsis RV86-5 line leads to cell death. In order to understand the downstream effects of this pathway, the ubK48R expressing line RV86-5 and the suppressor line of ubiquitin variant induced cell death, sud2, were used as tools. Fine mapping with 1239 recombinants narrowed down the sud2 mutant locus to the south arm of chromosome III, between loci At3g44400 and At3g44900. Problems caused by low recombination and repeated sequences were overcome by sub-genomic PCR-based amplification of a 350 kb region and subsequent Solexa sequencing of this region of interest. The data analysis tailored for nucleotide based comparison to reference sequence identified 15 candidates, 5 of which could be verified by conventional sequencing. In an alternative approach, microarray-based transcriptional expression differences between RV86-5 and sud2 identified 10 additional candidate suppressor genes, the majority of which are of unknown function. Among mutations in 9 of the tested candidates, 8 were able to prevent the lethal phenotype of RV86-5, indicating their involvement in the cell death process. The main interest of the ubiquitin research field is to identify E3-ligases and their interacting substrates. The second part of this work involved the search for novel E3 ligases that modify a known test protein with an aliphatic hydrophobic amino-terminal residue, Leu, which is targeted by none of the known plant N-end rule E3 ligases, PRT6 and PRT1. EMS mutagenesis on a plant line expressing a test protein with L-GUS followed by live tissue GUS staining, to screen for transgene stabilization, identified the 2 complementation groups PRT8 and PRT9, representing candidates for putative E3-ligases involved in destabilization of test proteins with amino-terminal Leu. The prt8 mutant shows delayed development. With the creation of a mapping population, the basis for the identification of locus was laid in this work. Arabidopsis mutants in the functionally unknown UBR domain proteins BIG and PRT7, which share homology with the mammalian N-end rule pathway components UBR4 and UBR7, were analyzed. A mutant in PRT7, isolated by T-DNA library screening, showed premature leaf senescence. In contrast, the big mutant showed delayed senescence and in addition no enzymatic affinity to test substrates with a basic N-terminus. Mutants were 9 isolated in two putative Arabidopsis deamidases, NTAN and NTAQ that are distantly related to mammalian deamidases. These were crossed into reporter lines expressing N-GUS and Q-GUS test proteins to deduce whether these enzymes provide substrates to Arg-t-RNA protein transferase as in mammals. These created mutants have laid the basis to analyse unknown functions of N-end rule pathway components in Arabidopsis. The importance of NO in signaling in plants has been long studied, but its molecular mechanism is still not well understood. In this work, it was found that in the Arabidopsis N-end rule pathway, NO targets test substrates with N-terminal Cys for degradation in a proteosome dependent manner and that this process is dependent on O2. With these results, strong evidence was obtained that the N-end rule pathway has a role in NO signaling and sensing. This finding has brought new insights into the plant N-end rule pathway. Taken together, the research work of this Thesis has developed new methods to overcome the low recombination problem during the mapping process, identified candidates that could potentially link the cell death processes to the ubiquitin dependent degradation pathway and identified putative E3-ligases of the N-end rule pathway by a novel way of EMS mutant screening supported by live tissue GUS assay. This research work found a connection between NO and the N-end rule pathway in A. thaliana. A complete set of mutants in all known plant N-end rule pathway components has been created, opening a window of possibility to further find natural substrates of this pathway.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Der Ubiquitin-26S-Proteasom-abhängige Proteinabbauweg und sein Teilbereich, der N-end-Rule-Weg, sind wichtige Ubiquitin-abhängige Vorgänge in Eukaryonten. Die meisten Substratproteine werden vorrangig durch das Proteosom ihrem Abbau zugeführt. Die Expression einer Ubiquitin-Variante mit Arg anstelle von Lys an Position 48 (ubK48R) in der Arabidopsis-LinieRV86-5 führt zum Zelltod. In dieser Arbeit wurden, um diesem Protein-Abbauweg nachgeschaltete Ereignisse zu verstehen, die ubK48R-exprimierende Linie RV86-5 und eine Suppressor-Linie des Ubiquitin-Varianten induzierten Zelltodes, sud2 (suppressor of ubiquitin variant induced cell death), als Hilfsmittel genutzt. Feinkartierung mit Hilfe von 1239 rekombinanten Pflanzenlinien grenzte die Position des mutierten SUD2-Lokus auf die Region des Chromosoms III zwischen den Genen At3g44400 und At3g44900ein. Durch niedrige Rekombinationsrate und repetitive Sequenzen verursachte Probleme wurden durch Herstellung einer sub-genomischen Bibliothek und anschließende Solexa-Sequenzierung dieser 350 kb großen Region überwunden. Die für einen Nukleotid-spezifischen Vergleich zu einer Referenz-Sequenz maßgeschneiderte Daten-Auswertung ermöglichte die Identifizierung von 15 Kandidaten für die sud2-Mutation, wovon fünf durch konventionelle Sequenzierung bestätigt werden konnten. Einer alternativen Strategie folgend, wurden mittels Microarray-Analyse von Transkriptmengen-Unterschieden zwischen RV86-5 und sud2 zehn weitere Kandidaten-Gene für Zelltod-Suppressoren identifiziert, von denen die meisten eine unbekannte Funktion haben. Von Mutanten in neun der untersuchten Kandidaten-Gene waren acht in der Lage, den letalen RV86-5 Phänotyp zu supprimieren, was auf ihre Wichtigkeit für den Zelltod hinweist. Ein Hauptinteresse der Ubiquitin-Forschung ist die Identifizierung von E3-Ligasen und ihrer Substrate. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Suche nach neuen pflanzlichen E3-Ligasen mit einer Funktion im N-end-Rule Weg. Kurzlebige Proteine mit der N-terminalen aliphatischen hydrophoben Aminosäure Leu werden von keiner der beiden bisher bekannten pflanzlichen N-end-RuleE3-Ligasen, PRT6 und PRT1, erkannt. Mittels EMS-Mutagenese einer Pflanzenlinie, die L-GUS als Test-Protein exprimiert, gefolgt von einer GUS-Färbung an lebenden Pflanzen zum Nachweis der Stabilisierung des Testproteins, wurden die zwei Komplementationsgruppen PRT8 und PRT9 identifiziert, welche putative E3-Ligasen mit einer Rolle in der Destabilisierung von Proteinen mit amino-terminalem Leu repräsentieren könnten. Die prt8-Mutante zeigt eine verzögerte Entwicklung. Mit der 7 Herstellung einer Kartierungs-Population wurde die Grundlage zur Identifizierung dieses Lokus geschaffen. Des Weiteren wurden in dieser Arbeit Arabidopsis-Mutanten der funktionell noch nicht charakterisierten UBR-Domäne-ProteinePRT7 und BIG analysiert, welche Homologie zu den Säugetier-N-end-Rule Komponenten UBR4 und UBR7 aufweisen. Eine prt7 Mutante, die mit Hilfe eines T-DNA-Bibliothek-Screens isoliert wurde, zeigte verfrühte Blatt-Seneszenz. Im Gegensatz dazu wies die big-Mutante verzögerte Seneszenz und zudem keine enzymatische Affinität zu Test-Substraten mit basischem N-Terminus auf. Im Rahmen dieses Projektes wurden außerdem Mutanten für die zwei Arabidopsis Deamidasen NTAN und NTAQ isoliert. Diese sind entfernt mit Säugetier-Deamidasen verwandt. Die Mutanten-Linien wurden mit Reporter-Linien gekreuzt, welche N-GUS bzw. Q-GUS exprimieren, um daraus abzuleiten, ob diese Enzyme – wie in Säugetieren – Substrate für Arg-t-RNA-Protein-Transferasen zur Verfügung stellen. Diese hier generierten Linien bilden die Grundlage zur Erforschung unbekannter Funktionen von Komponenten des N-end-Rule Weges in Arabidopsis. Die Bedeutung des NO-Signalweges in Pflanzen wird bereits lange untersucht, doch die molekularen Mechanismen desselben sind noch immer nicht gut verstanden. In dieser Forschungsarbeit wurde gezeigt, dass im N-end-rule Weg in Arabidopsis NO den Proteasom-vermittelten Abbau von Substraten mit N-terminalem Cys bewirkt und dass dieser Vorgang von Sauerstoff abhängig ist. Mit diesen Ergebnissen wurden starke Hinweise gefunden, dass der N-end-Rule Weg eine Rolle bei der NO-Signaltransduktion und -Rezeption spielen könnte. Dies erlaubt neue Einsichten in den pflanzlichen N-end-Rule Weg. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit neue Methoden zur Überwindung des Problems niedriger Rekombination während des Mappings entwickelt, mögliche Bindegliederzwischen Zelltod und Ubiquitin-abhängigem Proteinabbau identifiziert und neue putative E3-Ligasendes N-end-Rule Weges mit Hilfe einer neuartigen Methode des EMS-Mutanten-Screens, unterstützt durch GUS-Färbung an lebenden Pflanzen, entdeckt. Zudem hat diese Arbeit eine Verbindung zwischen NO und dem N-end-Rule Weg in A. thaliana aufgezeigt. Eine umfassende Sammlung von Mutanten des pflanzlichen N-end-Rule Weges wurde geschaffen, der eine Fülle an Möglichkeiten zur Identifizierung natürlicher Substrate der gefundenen Komponenten eröffnet. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Talloji, Prabhavathi prabha.talloji@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-49238
Date:	2011
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Ubiquitin, protein degradation, Arabidopsis English
Date of oral exam:	6 December 2011
Referee:	Name Academic Title George, Coupland Prof. Dr. Ulf-Ingo, Flügge Prof. Dr.
Funders:	DFG and FWF
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4923