Universität zu Köln

Kowalczyk, Sarah Katrin (2012). Charakterisierung der Interaktion von Gephyrin mit verschiedenen Untereinheiten des GABAA-Rezeptors. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Die γ-Aminobuttersäure-Rezeptoren Typ A (GABAARs) sind die wesentlichen inhibitorischen Liganden-gesteuerten Ionenkanäle im zentralen Nervensystem von Vertebraten. Für eine effiziente Signalweiterleitung ist ihre Lokalisation und Verankerung in der postsynaptischen Membran unverzichtbar. Im Gegensatz zum weniger komplexen Glycin-Rezeptor (GlyR), der über das zentrale Gerüstprotein Gephyrin an der Synapse stabilisiert wird, ist die Clusterung von GABAA-Rs weitaus komplexer und weniger gut verstanden. Immunhistochemische Färbungen verschiedener Hirnregionen aus Wildtyp- und knock-out-Mäusen lassen ebenfalls eine Gephyrin-abhängige GABAAR-Clusterung vermuten. Der Nachweis einer direkten Interaktion von Gephyrin mit den GABAAR-Untereinheiten α1 3 stützt diese Hypothese. In der vorliegenden Arbeit konnte eine weitere direkte Bindung von Gephyrin an die GABAAR-Untereinheiten β2, β3 und γ2 mittels Kosedimentationsanalysen gefunden werden, wobei die β-Untereinheiten – genau wie die α Untereinheiten sowie der GlyR-β-Loop – an das gleiche Motiv innerhalb der Gephyrin-E-Domäne binden. Der Verlust der Bindung der Gephyrin-Variante P713E an GABAAR-β2- und β3-Loops sowie Sequenzanalysen, die ein konserviertes Isoleucin bzw. Valin in allen Gephyrin-interagierenden GABAAR-Untereinheiten aufzeigen, lassen eine vergleichbare hydrophobe Wechselwirkung für alle Rezeptor-Bindungspartner vermuten. Die Bindung des Gephyrins an den β2-Loop erfolgt über dessen C-Terminus, wobei diese Interaktion in Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Messungen eine 10-fach schwächere Affinität zu Gephyrin aufwies (KD = 9,7 µM) als der GlyR-β-Loop. Auch die analytische Gelfiltration ließ auf einen im Vergleich zum GlyR-β-Loop wesentlich instabileren Komplex zwischen Gephyrin und dem GABAAR-β2-Loop schließen. Dies ist vergleichbar mit der Gephyrin-GABAAR-α1/3- sowie Rezeptor-Gerüstprotein-Interaktion an exzitatorischen Synapsen. Die Bindestelle im GABAAR-β2-Loop überlappt mit einem atypischen Bindungsmotiv für den an der Endocytose beteiligten AP2-Komplex. Basierend auf einer Phosphorylierung in diesem Motiv (Serin 410), was zu einer reduzierten Internalisierung führt, wurde ein wechselseitiger Mechanismus zur Regulation der Clusterung und Internalisierung der Rezeptoren auf Grundlage der β2 Untereinheit postuliert und durch eine verstärkte Bindung von Gephyrin an die phosphorylierte β2-Untereinheit unterstützt. Für die γ2-Untereinheit konnte ebenfalls eine phosphorylierungs-abhängige Bindung an Gephyrin gezeigt werden. Im unmodifizierten Zustand ist nur eine Bindung an die lange Spleiß-Variante (γ2L) nachweisbar, was die zusätzlichen alternativ gespleissten acht Aminosäuren als minimale Gephyrin-Bindungssequenz identifiziert. Die Phosphorylierung des Serins 327 verstärkt die Interaktion mit Gephyrin deutlich und befähigt auch die kurze Spleiß-Variante (γ2S) Gephyrin zu binden. Im Einklang mit veröffentlichten Daten erlauben die Daten dieser Arbeit einen Mechanismus zur Regulation des Equilibriums zwischen Clusterung und lateraler Diffusion aufgrund von einer NMDA-Rezeptor-induzierten Phosphatase-Aktivität zu postulieren.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Characterization of the interaction between gephyrin and different subunits of the GABAA-receptor English
Translated abstract:	Abstract Language γ-aminobutyric acid type A receptors (GABAARs) are the main inhibitory ligand-gated ion channels in the central nervous system of vertebrates. To ensure efficient signal transduction, their localization and clustering at postsynaptic sites is essential. In contrast to the glycine receptor (GlyR), which is stabilized at synapses via the scaffolding protein gephyrin, much less is known about the mechanisms underlying the clustering of the complex family of GABAARs which assemble into pentamers out of 19 different subunits. Immunohistochemical studies of different brain regions of wild type and knock-out mice suggested a gephyrin-dependent clustering mechanism for a subset of GABAARs. Recent studies, which have shown a direct interaction between gephyrin and the α1 3 subunits of the GABAAR, support this hypothesis. In this work, further interactions between gephyrin and GABAAR subunits β2, β3 and γ2 have been identified by cosedimentation. These experiments revealed a common binding site for the GlyR β and GABAAR α subunits located within the gephyrin E-domain. The lack of binding of the GABAAR β2 and β3 loops to gephyrin variant P713E as well as sequence analysis identified a conserved isoleucin or valin in gephyrin-interacting receptor subunits leading to the hypothesis that there is a shared binding mechanism which is based on similar hydrophobic interactions between the receptor loops and gephyrin. Binding between gephyrin and the GABAAR β2 subunit depends on a C-terminal motif within the intracellular loop and surface plasmon resonance measurements showed that it is one order of magnitude lower (KD = 9,7 µM) than it was shown for the GlyR β loop. Analytical gelfiltration underlined these findings and suggested a rapidly dissociating complex between the GABAAR β2 loop and gephyrin. This is comparable with data reported for the interaction of GABAAR α1 and α3 subunits with gephyrin as well for receptor interactions with their scaffolding proteins at excitatory synapses. The binding sequence within the GABAAR β2 loop overlaps with an atypical interaction motif for the AP2-complex which is necessary for receptor endocytosis. Based on a specific phosphorylation site in that motif (serine 410), which blocks internalization a reciprocal mechanism for the regulation of internalization and clustering of β2 subunit containing GABAARs is proposed, given that in this study an increased binding of gephyrin to a phosphorylated β2 loop-variant was found. The γ2 subunit showed a phosphorylation-dependent binding to gephyrin as well. Binding to the unmodified variant was only possible for the longer splice variant (γ2L) which identifies the additionally spliced eight amino acids in this isoform as minimal gephyrin binding motif. Phosphorylation of serin 327 increases the binding affinity and enables the short splice variant (γ2S) to bind Gephyrin as well. Together with already published data it can be assumed that γ2 phosphorylation regulates the equilibrium between clustering and lateral diffusion of receptors based on a NMDA-receptor induced phosphatase activity. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Kowalczyk, Sarah Katrin sarah.kowalczyk@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-49547
Date:	20 August 2012
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language gephyrin English GABAA-receptor English
Date of oral exam:	9 October 2012
Referee:	Name Academic Title Schwarz, Günter Prof. Dr. Kloppenburg, Peter Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4954