Molekulare Untersuchungen der mex-3/pal-1 Interaktion und genomweiter phylogenetischer Vergleich des MEX-3 Protein Netzwerks in Nematoden

Camps, Julia (2013). Molekulare Untersuchungen der mex-3/pal-1 Interaktion und genomweiter phylogenetischer Vergleich des MEX-3 Protein Netzwerks in Nematoden. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Die korrekte Lokalisation bestimmter maternaler Genprodukte ist essentiell für die Embryonalentwicklung des Modellorganismus C. elegans. Durch den Eintritt des Spermiums am posterioren Pol kommt es schon vor der ersten Teilung zum Bruch der Symmetrie und zur Etablierung der anterior posterioren Körperachse. Der anterior posterioren Verteilung der PAR Protein Komplexe folgt eine asymmetrische Teilung der Zygote in eine Soma- (AB) und eine Keimbahnzelle (P1). Letztere teilt sich im Folgenden asymmetrisch in die Keimbahnzelle P2 und die endo mesodermale Gründerzelle EMS, während sich AB symmetrisch in ABa und ABp teilt. Für die Musterbildung entlang der anterior posterioren Achse im 4 Zellstadium von C. elegans ist die Lokalisation des MEX-3 Proteins in den anterioren Blastomeren ABa und ABp, sowie die der pal-1 mRNA in den posterioren Zellen EMS und P2 notwendig. Hierbei wirkt das mRNA bindende KH Domänen Protein MEX-3 als negativer Regulator der pal-1 mRNA, indem es an das MEX-3 Recognition Element (MRE), eine konservierte Sequenz in der 3‘UTR bindet (Pagano et al., 2009)und so deren Abbau initiiert. Da prominente Unterschiede auf zellulärer Ebene gefunden worden waren, die für eine korrekte Frühentwicklung von C. elegans essentiell sind, habe ich in meiner Arbeit 9 Nematodenspezies auf zelluläre und molekulare Unterschiede zu C. elegans in untersucht. In keinem von diesen konnte ein zu C. elegans vergleichbares mex-3/pal-1 mRNA Expressionsmuster gefunden werden. Alle von mir untersuchten Nematoden besitzen im Gegensatz zu C. elegans sowohl für mex-3, als auch für pal-1 eine späte mRNA Expressionsdomäne. Für diese Arbeit von besonderer Bedeutung ist aber die frühe Lokalisation von mex-3 und pal-1 mRNA, die bei C. elegans anterior bzw. posterior zu finden ist. Diese konnte ebenfalls bei keinem untersuchten Nematoden gefunden werden. Es treten vielmehr gravierende Unterschiede im Expressionsmuster im Vergleich zu C. elegans auf. Sogar in einem nahen Verwandten von C. elegans sind sowohl die mex-3, als auch die pal-1 mRNA in den posterioren Blastomeren (EMS und P2) lokalisiert. In dieser Arbeit durchgeführte Genomsequenzanalysen zeigen, dass der, von C. elegans bekannte Mechanismus der Lokalisation von mex-3 und pal-1 mRNA innerhalb der Nematoden nicht konserviert sein kann. Das für die Bindung des MEX-3 Proteins an die pal-1 mRNA entscheidende MRE (Pagano et al., 2009) konnte von mir nur innerhalb der Gattung Caenorhabditis und in keiner der übrigen untersuchten pal-1 3’UTR Sequenzen gefunden werden. Dies lässt darauf schließen, dass bei den übrigen Nematoden keine negative Regulation der pal-1 mRNA durch das MEX-3 Protein stattfindet. Auch die für C. elegans essentielle Lokalisation des MEX-3 Proteins muss in den untersuchten Nematoden anders erfolgen. Homologe der MEX-5 und MEX-6 Proteine, die positive Regulatoren des MEX-3 Proteins sind und für dessen korrekte Lokalisierung in den anterioren Blastomeren ABa und ABp notwendig sind, konnten in keinem der untersuchten Nematoden gefunden werden. Das in der C. elegans Gonade zur Lokalisation der mex-3 und pal-1 mRNA essentielle GLD-1 Protein fehlt ebenfalls bei allen analysierten Spezies. Sein Homolog ASD-2, das bei C. elegans eine ganz andere Funktion erfüllt, konnte jedoch identifiziert werden. Möglicherweise übernimmt ASD-2 eine entscheidende Rolle in der Lokalisation der mex-3 und pal-1 mRNA nicht nur in der Gonade sondern auch während der frühen Embryonalentwicklung Um die Notwendigkeit des MRE für die mex-3/pal-1 Interaktion zu untersuchen, wurden transgene C. elegans hergestellt, die ein GFP::pal-1 3’UTR Fusionskonstrukt trugen.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Localisation of certain maternal gene products is essential for proper embryonic development in C. elegans. The sperm-entry at the posterior pole of the zygote represents a symmetry breaking event leading to the establishment of the anterior posterior body axis. An asymmetric division of the zygote produces the anterior somatic founder cell AB and its posterior sister, the germline cell P1. AB divides symmetrically into ABa and ABp, while P1 produces the endo mesodermal founder cell EMS and the germline cell P2. Correct pattern formation along the anterior posterior body axis in the C. elegans 4 cell stage requires anterior localisation of the MEX-3 Protein in ABa and ABp and the localisation of pal-1 mRNA in the posterior blastomeres P2 and EMS. Here, the mRNA binding Protein MEX-3, regulates negatively the pal-1 mRNA by binding the MEX-3 Recognition Element (MRE), located in the 3’UTR (Pagano et al., 2009) which initiates its degradation. As prominent differences in cellular processes essential for proper early embryonic development of C. elegans had been found in other nematodes I studied 9 different species for cellular and molecular differences compared to C. elegans. None of the analysed nematodes shows an expression pattern comparable to C. elegans. In all of them late expression domains of mex-3 as well as pal-1 were detected, which are absent in C. elegans. In my work I focused particular on the early expression patterns of mex-3 (anterior) and pal-1 (posterior) mRNA which are characteristic and essential for normal development in C. elegans. The pattern as found in C. elegans was not detected in any of the analysed nematodes. Instead, rather strong differences were observed. Even in close relatives of C. elegans, both, mex-3 and pal-1 mRNA are co-localised in the posterior EMS and P2 blastomeres. Genome analysis performed in this work revealed, that the mex-3/pal-1 mRNA localization mechanism known from C. elegans, is not conserved among nematodes. The MRE, which is essential for the interaction between the MEX-3 Protein and the pal 1 mRNA could not be found in the pal-1 3’UTR in all the nematodes analysed except C. elegans. This suggests, that in the other studied nematodes the MEX-3 protein does not act as a negative regulator of pal-1 mRNA. The mechanism for the specific localisation of the C. elegans MEX-3 Protein must have changed, too. MEX-5 and MEX-6 which positively regulate MEX-3 in ABa and ABp in C. elegans are absent in the other studied nematodes. In addition to their embryonic function mex-3 and pal-1 play a role during postembryonic germ cell development. In the C. elegans gonad it is GLD-1 which localises mex-3 and pal-1 mRNA. GLD-1 was found to be missing in all other studied species. However, the GLD homolog ASD-2, which has a completely different function in C. elegans could be identified there. It is suggested that ASD-2 may take over the GLD-1 function of mex-3 and pal-1 mRNA localisation not only in the gonad of non—C. elegans species but also during early embryogenesis. In order to test the necessity of the MRE for the mex-3/pal-1 interaction transgenic C. elegans were generated expressing GFP::pal-1 3’UTR fusion constructs.

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