Universität zu Köln

Koch, Kristina (2013). The role of Nuclear Factor κB in the cellular response to different radiation qualities. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Radiation is currently one of the most important limiting factors for manned space flight. During such missions, there is a constant exposure to low doses of galactic cosmic radiation and in particular high-energy heavy ions. Together this is associated with an increased cancer risk which currently cannot be sufficiently reduced by shielding. As such, cellular radiation response needs to be further studied in order to improve risk estimation and develop appropriate countermeasures. It has been shown that exposure of human cells to accelerated heavy ions, in fluences that can be reached during long-term missions, leads to activation of the Nuclear Factor κB (NF-κB) pathway. Heavy ions with a linear energy transfer (LET) of 90 to 300 keV/μm were most effective in activating NF-κB. NF-κB as an important modulating factor in the cellular radiation response could improve cellular survival after heavy ion exposure, thereby influencing the cancer risk of astronauts. The NF-κB pathway may be a potential pharmacological target in the mitigation of radiation response during space missions; such as the prevention of massive cell death after high dose irradiation (acute effects), in addition to neoplastic cell transformation during chronic low-dose exposure (late effects). The aim of this work was to examine the role of NF-κB in the cellular response to space-relevant radiation. Firstly, NF-κB activation in human embryonic kidney cells (HEK) after exposure to different radiation qualities and quantities was investigated. Key elements of different NF-κB sub-pathways were chemically inhibited to analyze their role in NF-κB activation induced by low and high LET ionizing radiation. Finally a cell line, stably transfected with a plasmid coding for a short-hairpin RNA (shRNA) for a knockdown of the NF-κB subunit RelA, was established to assess the role of RelA in the cellular response to space-relevant radiation. The knockdown was verified on several levels and the cell line was characterized concerning proliferation, cell cycle progression and gene expression. Additionally, the effects of the RelA knockdown on cell cycle progression, cellular survival and gene expression after exposure to low and high LET radiation were investigated. It was shown that activation of NF-κB depends on radiation quality and quantity. Experiments with chemical inhibitors revealed that NF-κB activation by ionizing radiation is strictly ATM dependent and degradation of the NF-κB inhibitor IκB by the proteasome is essential for both the classical and genotoxic stress-induced NF-κB pathway. Absence of NF-κB dimers containing RelA resulted in a prolonged lag-phase but did not affect cell cycle progression significantly in untreated cells. After irradiation, a dose and radiation quality dependent arrest in the G2 phase of the cell cycle occurred and also upon downregulation of RelA expression. RelA knockdown resulted in higher sensitivity of HEK cells to the killing effect of X-irradiation. In contrast, RelA knockdown did not further reduce the cellular survival after heavy ion exposure. Further, NF-κB target genes were not inducible in the RelA knockdown cell line. NF-κB-dependent gene expression rely on radiation dose and LET. Chemokine expression (e.g. CXCL1, 2, 8 and 10) was induced in a proportional manner to radiation quality and quantity, emphasizing the role of NF-κB in the bystander effect. These NF-κB regulated genes are interesting targets for countermeasure development against the effects of space radiation.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Weltraumstrahlung gilt derzeit als einer der wichtigsten limitierenden Faktoren für die bemannte Raumfahrt. Während solcher Missionen herrscht eine konstante Exposition mit geringen Dosen galaktischer kosmischer Strahlung, insbesondere hoch- energetischen Schwerionen. Dies wird mit einem erhöhten Krebsrisiko assoziiert, welches durch Abschirmung nicht ausreichend reduziert werden kann. Deshalb muss die zelluläre Strahlenantwort untersucht werden, um die Risikoabschätzung zu verbessern und angemessene Gegenmassnahmen zu entwickeln. Es wurde gezeigt, dass die Exposition von menschlichen Zellen mit beschleunigten Schwerionen in Fluenzen, die während Langzeitmissionen erreicht werden können, zur Aktivierung des Nuclear Factor κB (NF-κB) Signalweges führen. Schwerionen mit einem linearen Energietransfer (LET) von 90 bis 300 keV/μm hatten den stärksten Effekt auf die NF-κB Aktivierung. NF-κB als ein wichtiger regulierender Faktor in der zellulären Strahlenantwort könnte das zelluläre Überleben nach Schwerionenbestrahlung erhöhen und demnach das Krebsrisiko von Astronauten beeinflussen. Der NF-κB Signalweg könnte ein potentieller pharmakologischer Angriffspunkt für die Abschwächung der Strahlenantwort während Weltraummissionen sein, um den massiven Zelltod nach Bestrahlung mit hohen Dosen (akute Effekte) oder neoplastische Zelltransformation nach chronischer Bestrahlung mit niedrigen Dosen (Spätfolgen) zu verhindern. Das Ziel dieser Arbeit war der Kenntnisgewinn über die Rolle von NF-κB in der zellulären Antwort auf weltraumrelevante Strahlung. Zuerst wurde die NF-κB Aktivierung in menschlichen embryonalen Nierenzellen (human embryonic kidney cells, HEK) nach Exposition mit verschiedenen Strahlenqualitäten und -quantitäten untersucht. Zentrale Elemente verschiedener NF-κB Signalwege wurden durch Chemikalien inhibiert, um deren Rolle in der NF-κB Aktivierung, induziert durch ionisierende Strahlung mit niedrigem und hohem LET, zu analysieren. Zuletzt wurde eine Zellinie mit einem short-hairpin RNA (shRNA) Plasmid für den Knockdown der NF-κB Untereinheit RelA stabil transfiziert, um die Rolle von RelA in der zellulären Antwort auf weltraumrelevante Strahlung abzuschätzen. Der Knockdown wurde auf verschiedenen Ebenen verifiziert und die Zellinie wurde hinsichtlich Proliferation, Zellzyklus-Progression und Genexpression untersucht. Zusätzlich wurden die Effekte des RelA Knockdowns auf Zellzyklus-Progression, zelluläres Überleben und Genexpression nach Exposition mit Strahlung mit niedrigem und hohem LET untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Aktivierung von NF-κB von Strahlenqualität und -quantität abhängig ist. Experimente mit chemischen Inhibitoren zeigten, dass NF-κB Aktivierung durch ionisierende Strahlung strikt ATM abhängig ist und der Abbau des NF-κB Inhibitors IκB durch das Proteasom essentiell ist für beide, den klassischen und den durch genotoxischen Stress induzierten NF-κB Signalweg. Abwesenheit von RelA-enthaltenden NF-κB-Dimeren resultierte in einer verlängerten lag-Phase, hatte aber keinen signifikanten Einfluss auf die Zellzyklus-Progression in unbehandelten Zellen. Nach Bestrahlung wurde auch in der RelA Knockdown Zellinie ein von Dosis und Strahlenqualität abhängiger Arrest in der G2 Phase des Zellzyklus beobachtet. Der RelA Knockdown resultierte in erhöhter Sensitivität von HEK Zellen für den abtötenden Effekt von Röntgenstrahlung. Im Gegensatz dazu reduziert der RelA Knockdown das zelluläre Überleben nach Schwerionenbestrahlung nicht stärker. Des Weiteren waren Zielgene von NF-κB in der RelA Knockdown-Zellinie nicht induzierbar. Die NF-κB-abhängige Genexpression ist abhängig von Strahlendosis und LET. Die Expression von Chemokinen (z. B. CXCL1, 2, 8 und 10) wurde proportional zu Strahlenqualität und -quantität induziert, und unterstreicht somit die Rolle von NF-κB im Bystander-Effekt. Diese NF-κB regulierten Gene sind interessante Angriffspunkte für die Entwicklung von Massnahmen gegen die Effekte von Weltraumstrahlung. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Koch, Kristina tinakoch81@yahoo.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-51289
Date:	2013
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language radiation, space flight, heavy ions, Nuclear Factor κB (NF-κB), linear energy transfer (LET), human embryonic kidney cells (HEK), short-hairpin RNA (shRNA), RelA, X-rays, chemokines, survival UNSPECIFIED
Date of oral exam:	11 April 2013
Referee:	Name Academic Title Dohmen, Jürgen Prof. Dr. Niessen, Carien Prof. Dr. Hellweg, Christine E. PD Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5128