Universität zu Köln

Weßling, Ralf (2012). Isolation and functional characterization of Arabidopsis powdery mildew effector proteins. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Plants are resistant to the majority of potential pathogenic microbes. Adapted pathogens can however overcome plant defense and induce susceptibility. The molecular processes underlying this adaptation are only partially understood. Obligate biotrophic pathogens, which require a living host for growth and reproduction, establish especially intimate relationships with their plant hosts. A crucial aspect of this lifestyle is the formation of a specialized infection structure termed the haustorium. Haustoria are believed to represent pivotal sites of nutrient uptake and deliver effectors, proteins that manipulate the host cell during infection to promote susceptibility. While the effector arsenal of pathogenic bacteria has been investigated intensively, the repertoires and host targets of fungal effectors are currently underexplored. The work presented here thus aims at characterizing virulence mechanisms employed by the obligate biotrophic Ascomycete Golovinomyces orontii, the causal agent of the powdery mildew disease in Arabidopsis thaliana (hereafter Arabidopsis). To this end, the haustorial transcriptome of G. orontii was obtained by pyrosequencing of a cDNA library generated from isolated haustorial complexes. Transcripts coding for gene products with roles in protein turnover, detoxification of reactive oxygen species and fungal pathogenesis were abundant, while surprisingly transcripts encoding presumptive nutrient transporters were not highly represented in the haustorial cDNA library. A substantial proportion (~38%) of transcripts encoding predicted secreted proteins comprised effector candidates. These candidates were cloned and found to frequently suppress induced plant cell death. A subset of effectors enhanced bacterial virulence and could suppress callose deposition, indicating a role in defense suppression. Transcript profiling of these effectors suggested their sequential delivery during pathogenesis. Furthermore, subcellular localization revealed diverse target compartments in the host. In a complementing approach, a large-scale yeast 2-hybrid (Y2H) assay was performed on the 84 cloned effector candidates and revealed convergence onto 61 potential host targets. These targets were enriched in transcription factors and components involved in development and cellular trafficking. Bimolecular fluorescence complementation assays confirmed the interaction of selected effectors with their host interactors. Finally, the Y2H targets of effectors were used to construct an integrated protein-protein interaction network of Arabidopsis and the three adapted pathogens Pseudomonas syringae (Psy), Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa) and G. orontii. This network revealed pathogen-specific as well as nine common host targets. These common targets are highly connected in the Arabidopsis cellular network. After the development of suitable quantitative methods, the important role of these common targets in the Arabidopsis immune response was validated by screening respective T-DNA insertion lines. In sum, my work supports the hypothesis that pytopathogenic microbes target hubs in the host cellular network to promote susceptibility. The effector targets identified will therefore form the basis of subsequent effector research in G. orontii.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Isolation und funktionale Charakterisierung von Effektorproteinen des Arabidopsis Mehltau German
Translated abstract:	Abstract Language Pflanzen sind immun gegen den Großteil potentieller Schädlinge. Angepasste Schädlinge können die pflanzlichen Verteidigungsmechanismen allerdings überwinden und so die Pflanze für eine Infektion empfänglich machen. Die molekularen Prozesse, die dieser Anpassung zugrundeliegen sind nur teilweise verstanden. Obligat biotrophe Schädlinge, welche auf einen lebenden Wirt für Wachstum und Vermehrung angewiesen sind, etablieren eine besonders enge Beziehung mit ihrem pflanzlichen Wirt. Ein kritischer Aspekt dieser Lebensform ist die Bildung einer spezialisierten Infektionsstruktur, des Haustoriums. Das Haustorium ist entscheidend für sowohl die Nahrungsaufnahme als auch die Sekretion von Effektoren, kleinen Proteinen die die Wirtszelle manipulieren und so empfänglich für eine Besiedlung machen. Während die Effektorarsenale von Bakterien bereits intensiv erforscht wurden, sind die Effektoren von pilzlichen Schädlingen sowie ihre Zielproteine in der Wirtszelle noch weitgehend unbekannt. Die hier präsentierte Arbeit zielt deshalb auf das Verständnis der Virulenzmechansimen des obligat biotrophen Schlauchpilzes (Ascomycet) Golovinomyces orontii, des Erregers des Mehltaus auf Arabidopsis thaliana (folgend Arabidosis). Dazu wurde das haustorielle Transkriptom von G. orontii durch die Pyro-Sequenzierung einer cDNA-Bibliothek aus isolierten haustoriellen Komplexen charakterisiert. Viele Transkripte kodierten für Proteine mit Funktionen in der Proteinumsetzung, der Entgiftung von reaktiven Sauerstoffspezies und pilzlicher Pathogenese. Überraschenderweise konnten nur wenige Transkripte für mögliche Nährstofftransporter identifiziert werden. Ein substanzieller Anteil (38%) der Transkripte für vorhergesagte sekretierte Proteine kodiert für Effektorkandidaten. Diese Kandidaten wurden kloniert und konnten häufig induzierten pflanzlichen Zelltod unterdrücken. Eine Untergruppe der Effektorkandidaten erhöhte die Virulenz von Bakterien und verringerte teilweise die Ablagerung von Callose. Zusammengenommen weist dies auf eine Rolle in der Unterdrückung der pflanzlichen Verteidigungsmechanismen hin. Die Analyse der Transkriptprofile dieser Kandidaten deutete auf eine sequentielle Produktion während der Infektion hin. Außerdem zeigten Lokalisationstudien unterschiedliche subzelluläre Zielkompartimente der einzelnen Effektorkandidaten. In einer komplementären Herangehensweise wurde eine großmaßstäbliche Hefe-Zwei-Hybird (Y2H) Analyse der 84 klonierten Effektorkandidaten durchgeführt. Dieser Ansatz enthüllte die Konvergenz der Kandidaten auf 61 potentielle Zielproteine des Wirtes. In diesen Zielproteinen sind Transkriptionsfaktoren sowie Komponenten aus der Pflanzenentwicklung und dem zellulären Transport überrepräsentiert. Versuche über die bimolekulare Fluoreseszens-komplementation bestätigten die Interaktion von ausgewählten Effektoren mit den jeweiligen Wirtsproteinen. Schließlich wurden die Y2H-Interaktoren der Effektorkandidaten zur Konstuktion eines integrierten Protein-Protein Interaktions-Netzwerks von Arabidopsis und den drei adaptieren Schädlingen Pseudomonas syringae (Psy), Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa) und G. orontii genutzt. Dieses Netzwerk enthüllte sowohl Schädling-spezifische als auch gemeinsame Zielproteine im Wirt. Die gemeinsamen Zielproteine sind hochvernetzt im zellulären Netzwerk von Arabidopsis. Nach der Entwicklung geeigneter quantitativer Methoden konnte eine Rolle dieser Proteine in der Immunantwort von Arabidopsis durch die Analyse von entsprechenden T-DNA-Insertionsmutanten bestätigt werden. Die hier präsentierte Arbeit unterstüzt die Hypothese das mikrobielle Pflanzenschädlinge hochvernetzte Proteine in der Pflanze angreifen um ihre Anfälligkeit zu erhöhen. Die identifizierten Effektoren und Zielproteine werden daher die Grundlage für eine weitere Erforschung des Arabidopsis-Mehltaus bilden. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Weßling, Ralf ralf_wessling@web.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-51477
Date:	October 2012
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Powdery Mildew English Arabidopsis English Effector English
Date of oral exam:	7 December 2012
Referee:	Name Academic Title Schulze-Lefert, Paul Prof. Dr. Hülskamp, Martin Prof. Dr. Takken, Frank L.W. Dr.
Funders:	International Max-Planck Research School Cologne
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5147