Universität zu Köln

Weber, Stefanie (2013). Fremde DNA im menschlichen Genom: Konsequenzen für das Wirts- und das Fremdgenom. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Die Integration fremder DNA in ein Wirtszellgenom ist ein häufiges Ereignis in der Natur, kann aber auch künstlich herbei geführt werden. Etwa 45% des menschlichen Genoms bestehen aus fremder DNA. Die Integration von Fremd- DNA kann sich dabei funktionell sowohl auf das Wirtsgenom wie auch auf das Transgenom auswirken. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde daher der Einfluss der Integration von Fremd- DNA in ein menschliches Wirtsgenom untersucht. Als Modell wurden Einzelzellklone der Tumorzelllinie HCT- 116 mit stabil integriertem Plasmid zunächst auf Veränderungen im DNA- Methylierungsmuster der endogenen Retroviren HERV- K und HERV- W sowie des Retrotransposons LINE 1 im Vergleich zu nicht transfizierten HCT- 116 Zellen untersucht. Da bei den drei ausgewählten Retroelementen keine signifikanten Veränderungen im DNA- Methylierungsmuster im Vergleich zu Einzelzellklonen ohne Integrat beobachtet wurden, sind vertiefende GeneChip®Expressions Analysen durchgeführt worden. Die Transkriptionsaktivität der nicht transgenen wurde mit den transgenen Zellen verglichen. Bei 144 der 28.829 analysierten Genomabschnitte konnte eine Überexpression und bei weiteren 198 eine deutlich verminderte Genexpression beobachtet werden. Die Expressionsanalyse von fünf nicht transgenen Einzelzellklonen zeigte, dass die beobachteten Veränderungen in der Transkriptionsaktivität nicht auf der biologischen Variabilität der Kontrollen zurückzuführen sind. Die Integration von Fremd- DNA führte in den transgenen Zellen zu einem veränderten Expressionsmuster. Integrierte virale DNA wird oftmals de novo methyliert um eine transkriptionelle Stilllegung des Integrats und eine damit verbundene Stabilisierung des Wirtszellgenoms zu erreichen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Periphere Blutmonozyten (PBMC) HIV- 1 infizierter Probanden daraufhin untersucht, ob ein Zusammenhang im DNA- Methylierungsmuster von HIV- 1 proviralen Genomen und der Progression der HIV- 1 Erkrankung zu AIDS besteht. Hierfür wurden PBMCs von HIV- 1 infizierten Probanden mit unterschiedlichem Krankheitsverlauf (long term nonprogressors, Elite- Controllers, chronisch mit HIV- 1 infizierte Probanden und an AIDS erkrankte Patienten) mittels Bisulfit- Sequenzierung genomischer DNA auf Veränderungen im Methylierungsstatus untersucht. In den proviralen Genomen wurden die 5´LTR und 3´LTR- Regionen sowie Teilbereichen in den viralen Genen von gag, env, nef, rev und tat analysiert. Bei 19 von 20 untersuchten Probanden wurden nur vollständig nicht methylierte CpG- Dinukleotide beobachtet. Lediglich bei einer Probandin aus der Gruppe der long term nonprogressors, variierte der CpG- Methylierungstatus zwischen 0 und 75% in einem Zeitraum von 11 Jahren nach der Infektion. Eine Korrelation zwischen Viruslast und den zeitweisen Schwankungen im Methylierungsstatus des proviralen Genoms konnte nicht beobachtet werden. Bei der Sequenzanalyse der Bisulfit- behandelten DNA aus den Patienten fiel auf, dass bestimmte CpG- Folgen an spezifischen Stellen im proviralen Genom immer wieder mutiert waren. Auch der Sequenzvergleich mit 12 zufällig ausgewählten proviralen HIV- 1 Sequenzen aus der Los Alamos HIV- 1 Sequenzdatenbank zeigten Mutationen an denselben Stellen. Die beobachteten Mutationen könnten auf Schwachstellen im proviralen Genom hinweisen, die das Überleben des Virus im Wirtsgenom sichern. Das hauptsächliche Vorkommen nicht methylierter CpG- Folgen im proviralen HIV- 1 Genom, lässt darauf schließen, dass es andere nicht epigenetische Mechanismen zum Erhalt der Latenz des HIV- 1 Provirus im zellulären Genom geben muss.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language The integration of foreign DNA into cellular genomes occurs frequently, but could also be induced artificially. About 45% of the human genome contains foreign DNA. It is known that integration of foreign DNA has an effect on both the host genome as well as on the transgenome. In the first part of this study, the impact of foreign DNA integration into a human genome was analyzed. As a model, single-cell clones of the human tumor cell line HCT- 116 were stably transfected with plasmid DNA and changes in the DNA methylation patterns of the endogenous retrovirus HERV-K and HERV-W as well as of the retrotransposon LINE 1 were analyzed. In relation to non-transfected HCT- 116 single cell clones, genomic integration of foreign DNA did not affect the methylation patterns of the three retroviral elements. Furthermore, GeneChip®expression arrays were performed and gene expression patterns of native and stably transfected cell clones were compared. In total 28.829 genes were investigated. Whereas, the expression level of 144 genes was increased, the expression of 198 genes was down regulated due to DNA integration. The expression analysis of five non-transgenic single cell clones showed that the observed changes in transcriptional activity are not due to the biological variability of the controls. The data demonstrate, that integration of foreign DNA influences the transcription level of the host cell. Integrated viral DNA often becomes de novo methylated leading to transcriptional inactivation. In the second part of the thesis peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of HIV- 1 infected individuals were investigated for a possible relationship between DNA methylation patterns of HIV- 1 proviral genomes and the progression of HIV- 1 disease to AIDS. The DNA was isolated from individuals with quite different courses of HIV- 1 infection: long term nonprogressors, elite controllers, progressors, patients with AIDS. DNA methylation patterns of the proviral HIV- 1 5´ and 3´LTR as well as of portions of the viral genes gag, env, nef, rev, and tat were then analyzed by the bisulfite sequencing technique. Whereas, the DNA specimens of 19 of the 20 HIV- 1 infected individuals indicated that the proviral DNA was completely unmethylated in all sequences analyzed, one long-term non-progressor could be identified whose DNA showed differences in the proviral methylation pattern. The overall percentage of methylated CpG´s in the proviral DNA of this donor varied between 0 and 75% at different times after infection. The analyses in this individual covered a time course of 11 years. Interestingly, no correlation between viral load and methylation rate could be observed. Surprisingly however, irrespective of the phenotype of disease progression, several CpG dinucleotides located at specific sites in the proviral HIV- 1 genome could be identified. These CpG’s were mutated in the majority of patients. Comparative analyses of these nucleotide sequences to 12 randomly selected sequences in the Los Alamos HIV- 1 database verify these CpG´s as actual mutational hotspots. Taken together, the preferentially mutated CpG´s may indicate weak sites in the HIV- 1 proviral genome that might somehow secure the survival of the provirus in the host genome. Moreover, the data demonstrate that the degree of proviral DNA methylation may fluctuate temporally. The marked predominance of unmethylated CpG’s in the HIV- 1 proviral genome indicates that proviral DNA methylation may not the dominant regulator of HIV- 1 gene silencing in PBMC’s. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Weber, Stefanie siweber@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-53545
Date:	May 2013
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Epigenetik, DNA- Methylierung, Endogene Retroviren, HIV German epigenetic, DNA methylation, endogenous retroviruses, HIV English
Date of oral exam:	1 July 2013
Referee:	Name Academic Title Doerfler, Walter Prof. Dr. Brüning, Jens Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5354