Universität zu Köln

Liu, Liangyu (2013). A distal enhancer controls transcription of FLOWERING LOCUS T in Arabidopsis. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Control of flowering time is critical for reproductive success. In Arabidopsis thaliana, the gene FLOWERING LOCUS T (FT) encodes part of florigen, which moves from leaves to the shoot apex to induce the floral transition. Under inductive long days (LD), transcription activation is mainly mediated by CONSTANS (CO). The epigenetic repressor LHP1, which associates with H3K27me3, antagonizes CO activity in vascular tissues at FT. The 5.7 kb sequence upstream of the FT translation start codon contains sufficient regulatory elements to mediate spatial and temporal expression of FT. On this full length FT promoter, phylogenetic analysis identified three conserved blocks, each around 300 bp, called Block A, B and C. The aim of my study was to identify and characterize functional cis-elements within the conserved blocks and elucidate the molecular mechanisms of FT transcription regulation. My results indicate that Block C (5.2 to 5.6 kb upstream of the transcriptional start site) is necessary for FT expression in LD conditions, and that CCAAT boxes in Block C and close to Block A at the proximal promoter impair the efficiency of a full length FT promoter. Mutagenesis of either one of four conserved sub-blocks in Block C dramatically reduces promoter activity. Although Block C acts as distal enhancer, it requires specific sequences contained in Block A to convey phloem-specific expression of FT in leaves. Through Chromosome Conformation Capture (3C) assays, a weak long-distance physical interaction between Block C and A could be detected. The distance between Block C and A displays natural variation among different A. thaliana accessions. Shortening the distance between the blocks by deleting 3.5 kb intersecting region or directly connecting Block C and A, generated shorter versions of the FT promoter that mimic the full-length promoter function in response to LDs. How the repressive histone mark H3K27me3 and LHP1 contribute to FT regulation is still unclear. To study differential enrichment of H3K27me3 at the FT promoter, nuclei were isolated by INTACT (isolation of nuclei tagged in specific cell types) from the leaf phloem of plants grown in LD or SD conditions. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) revealed that the abundance of H3K27me3 at Block C and A regions negatively correlated with FT expression levels in the phloem. Taken together, the distal enhancer Block C and Block A in the proximal promoter are accessible in leaf phloem cells and required and sufficient for FT expression in LD conditions.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Für eine erfolgreiche pflanzliche Vermehrung ist es unumgänglich den Blühzeitpunkt zu kontrollieren. In Arabidopsis thaliana kodiert das Gen FLOWERING LOCUS T (FT) einen Teil des „florigen“, welches sich von den Blättern zum Apex der Pflanze bewegt, um dort das Blühen einzuleiten. In induzierenden Langtagbedingungen (LD), wird die Aktivierung der FT Transkription hauptsächlich über CONSTANS (CO) gesteuert. Das epigenetische Repressionsprotein LHP1, welches mit H3K27me3 assoziiert, fungiert antagonistisch zu der CO Aktivität in Bezug auf FT im vaskulären Gewebe. Die 5,7 kb Promotersequenz vor dem Startcodon von FT enthält regulatorische Elemente, die ausreichen, um eine örtlich und zeitlich begrenzte Expression von FT zu gewährleisten. Auf diesem funktionalen FT Promoter wurden drei konservierte Blöcke durch phylogenetische Analysen identifiziert. Jeder der Blöcke (Block A, B und C) ist etwa 300 bp lang. Meine Arbeit hatte die Identifikation und Charakterisierung funktionaler cis-Elemente innerhalb der konservierten Promoterblocks zum Ziel. Somit sollte zum Verständnis der molekularen Mechanismen beigetragen werden, welche die FT Transkription regulieren. Meine Ergebnisse deuten an, dass Block C (5.2 – 5.6 kb vor dem FT Transkriptionsstart) essentiell für die FT Expression in LD Bedingungen ist. Zusätzlich scheinen die CCAAT Elemente in Block C und nahe Block A im proximalen Promoter die Effizienz des Gesamtpromoters von FT direkt zu beeinflussen. Wenn man vier konservierte Unterblöcke in Block C durch Mutagenese verändert, führt dies zu stark verminderter Aktivität des Promoters. Obwohl Block C die Aktivität von FT aus der Distanz beeinflusst, sind zusätzlich spezifische Sequenzen in Block A nötig, um eine phloemspezifische Expression von FT in Blättern zu gewährleisten. Durch Chromosome Confirmation Capture (3C) konnte eine schwache physikalische Interaktion zwischen Block C und Block A nachgewiesen werden. Die Distanz zwischen Block C und A weist natürliche Variation zwischen verschiedenen A. thaliana Akzessionen auf. Die Verkürzung der Distanz zwischen den Blöcken, durch die Beseitigung des 3,5 kb umfassenden Zwischenregion oder die direkte Verbindung zwischen Block C und A, generierten kürzere Versionen des FT Promoters, die die Funktion des kompletten FT Promoters in LD Bedingungen imitierten. Es bleibt weiterhin unklar, wie die repressive Histonmarkierung H3K27me3 und LHP1 zur FT Regulation beitragen. Um differenzierte Anreicherung von H3K27me3 am FT Promoter zu untersuchen, wurden Zellkerne durch INTACT (Isolation von in bestimmten Geweben markierten Zellkernen) aus dem Blattphloem von Pflanzen, die in LD oder SD Bedingungen gewachsen waren, isoliert. Mit Hilfe von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) konnte gezeigt werden, dass die Häufigkeitsverteilung von H3K27me3 an Block C und A im Phloem negativ mit der der Expression von FT korrelierte. Zusammen genommen sind der entfernte Expressionsverstärker Block C und Block A im proximalen Promoter in Blattphloemzellen verfügbar und sowohl nötig als auch ausreichend für die Expression von FT in LD Berdingungen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Liu, Liangyu liu@mpipz.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-53633
Date:	16 November 2013
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Flowering Locus T, Transcription regulation, flowering time English
Date of oral exam:	9 April 2013
Referee:	Name Academic Title Coupland, George Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5363