Universität zu Köln

Kerner, Konstantin (2020). Domain-Specific Function and Subcellular Localization of Components of the COP1/SPA Complex in Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Light affects almost all stages of plant development. To adequately adapt to changes in ambient light, plants have evolved a complex regulatory network to perceive and subsequently transmit light signals. One of the central regulators of light signaling in the model plant Arabidopsis thaliana is the COP1/SPA complex. This tetrameric complex is part of an E3 ubiquitin ligase complex which marks positive regulators of photomorphogenesis for degradation by polyubiquitination, thereby regulating important light-dependent processes like seedling de-etiolation, shade-avoidance responses, vegetative growth, and the induction of flowering. Both COP1 and SPA proteins contain C-terminal WD-repeats which are essential for interaction with many different players in the light-signaling cascade, and by extension for COP1/SPA function. The COP1/SPA complex has been studied extensively over the past two decades, but many aspects of COP1/SPA function are yet to be fully understood. In the first part of this study, I analyzed both structural and functional differences between the COP1 and SPA1 C-terminal WD-repeat domains. First, by using structural X-ray data of the COP1 WD-domain, I generated a homology model of the SPA1 WD-repeat domain. I was able to identify several structural differences between both domains. First, sequence homology analysis showed that one residue that has previously been shown to be involved in the interaction of COP1 with a peptide of HY5 containing the VP binding motif is not conserved within SPA1. Second, two residues which are involved in the interaction with COP1 and a substrate of its homolog in humans, Trib1, are oriented differently in the substrate binding pocket of SPA1. Third, the homology model showed that two loops in the SPA1 WD-repeat domain are likely structurally different from COP1. Next, I generated chimeric hybrid proteins of COP1 and SPA1 that had their WD-repeat domains interchanged (CC1 and 11C). These proteins were proven to be functionally active in yeast two-hybrid and colocalization analysis. When expressed in plants, CC1 was able to rescue the mutant phenotype of dark-grown cop1 mutants. In contrast, 11C was unable to rescue the mutant phenotype of dark-grown higher order spa mutants, indicating that the SPA1 WD-repeat domain is essential for COP1/SPA function, whereas the COP1 WD-repeat domain is not. CC1 was able to partially rescue adult phenotypes of cop1 mutants, but 11C triggered a dominant negative phenotype in adult higher order spa mutants. Lastly, molecular analysis showed that endogenous COP1 accumulated in dark-grown seedlings expressing 11C, indicating that 11C proteins may inactivate endogenous COP1. Taken together, these results indicate that the SPA1 WD-repeat domain is both structurally and functionally divergent from the homologous region of COP1. In the second part of this study, I investigated the light-dependent subcellular localization of COP1 and SPA1 proteins. Nuclear exclusion of COP1 was dependent on SPA proteins in white light, but nuclear COP1 in spaQn mutants appeared to be inactive, demonstrating at least a dual role of SPA proteins in the regulation of COP1 activity. Analysis of COP1 localization in monochromatic light showed that nuclear exclusion of COP1 is likely regulated by a complex, non-additive interplay between phytochromes and cryptochromes. Finally, SPA1 also failed to localize into nuclear photobodies in white light, but whether this is due to nuclear exclusion of SPA1, SPA1 degradation or a combination of both remains unclear. In conclusion, these results show that SPA proteins are required both for the nuclear exclusion of COP1 and COP1 activity in general, whereas light-dependent nuclear localization of SPA1 remains to be investigated further.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Licht beeinflusst so gut wie alle Phasen der Entwicklung von Pflanzen. Um angemessen auf Änderungen der umgebenden Lichtbedingungen reagieren zu können, hat sich in Pflanzen ein komplexes regulatorisches Netzwerk entwickelt, um Lichtsignale wahrnehmen und weiterleiten zu können. Einer der zentralen Regulatoren der Lichtsignaltransduktion ist der COP1/SPA Komplex. Dieser tetramerische Komplex ist Teil eines E3 Ubiquitinligasekomplexes, welcher positive Regulatoren der Photomorphogenese durch Polyubiquitinierung zur Degradation markiert und dadurch wichtige lichtabhängige Prozesse wie Deetiolierung von Keimlingen, Schattenvermeidungsantworten, vegetatives Wachstum und die Induktion der Blüte reguliert. Sowohl COP1 als auch SPA Proteine besitzen C-terminale WD-Wiederholungen, die essenziell für die Interaktion mit vielen verschiedenen Mitspielern in der Lichtsignalkaskade und damit für die Funktionalität von COP1/SPA, sind. Der COP1/SPA Komplex wurde in den letzten zwei Jahrzehnten umfangreich studiert, doch viele Aspekte der Funktion von COP1/SPA sind noch nicht voll und ganz verstanden. In dem ersten Teil dieser Studie habe ich sowohl strukturelle als auch funktionelle Unterschiede zwischen der C-terminalen WD-Wiederholungsdomänen von COP1 und SPA1 analysiert. Durch die Nutzung von strukturellen Infrarotdaten der COP1 WD-Wiederholungsdomäne habe ich ein homologes Modell der SPA1 WD-Wiederholungsdomäne generiert. Ich konnte einige strukturelle Unterschiede zwischen beiden Domänen feststellen. Erstens hat die Analyse von Sequenzhomologie gezeigt, dass ein Aminosäurerest, von dem zuvor gezeigt worden war, dass er in die Interaktion zwischen COP1 und einem HY5 Peptid, welches das VP Bindemotif enthielt, nicht in SPA1 konserviert ist. Zweitens sind zwei Aminosäurereste, die in die Interaktion von COP1 und einem Substrat seines Homologs in Menschen, Trib1, involviert sind, in der Substratbindetasche von SPA1 anders orientiert. Drittens hat das Homologie Modell gezeigt, dass zwei Schleifen in der SPA1 WD-Wiederholungsdomäne sich wahrscheinlich von COP1 strukturell unterscheiden. Als nächstes habe ich chimärische Hybridproteine zwischen COP1 und SPA1, deren WD-Wiederholungsdomänen miteinander ausgetauscht wurden (CC1 und 11C), generiert. Diese Proteine waren funktionell aktiv in Hefe zwei-Hybrid- und Colokalisationsstudien. In Pflanzen exprimiert war CC1 in der Lage, den Mutanten Phänotyp von in Dunkelheit angezogenen cop1 Mutanten zu rekonstituieren. Dagegen war 11C nicht in der Lage den Mutanten Phänotyp von höherrangigen, in Dunkelheit angezogenen spa Mutanten zu retten, was zeigt, dass die SPA1 WD-Wiederholungsdomäne essenziell für die Funktionalität von COP1/SPA ist, die COP1 WD-Wiederholungsdomäne hingegen nicht. CC1 war in der Lage, adulte Phänotypen von cop1 Mutanten partiell zu retten, wohingegen 11C dominant negative Phänotypen in adulten höherrangigen spa Mutanten hervorgerufen hat. Zuletzt haben molekulare Analysen gezeigt, dass endogenes COP1 in im Dunkeln angezogenen Keimlingen, die 11C exprimieren, akkumuliert, was andeutet, dass 11C möglicherweise endogenes COP1 inaktiviert. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die SPA1 WD-Wiederholungsdomäne sich sowohl strukturell als auch funktionell von ihrer homologen Region in COP1 unterscheidet. Im zweiten Teil dieser Studie habe ich die lichtabhängige subzelluläre Lokalisation von COP1 und SPA1 Proteinen untersucht. Der Ausschluss von COP1 aus dem Nukleus ist abhängig von SPA Proteinen in weißem Licht, doch nuklear lokalisiertes COP1 scheint inaktiv in spaQn Mutanten zu sein, was zeigt, dass SPA Proteine mindestens eine zweiteilige Rolle in der Regulation der Aktivität von COP1 haben. Die Analyse der Lokalisation von COP1 in monochromatischem Licht hat gezeigt, dass der Export von COP1 aus dem Nukleus wahrscheinlich von einem komplexen, nichtadditiven Zusammenspiel von Phytochromen und Cryptochromen reguliert wird. SPA Proteine waren ebenfalls nicht in Lichtkörper im Nukleus lokalisiert, doch ob dies aufgrund des Exports von SPA1 aus dem Nukleus, der Degradation von SPA1 oder einer Kombination von beidem zu beobachten ist, ist noch unklar. Als Fazit zeigen diese Ergebnisse, dass SPA Proteine sowohl für den Ausschluss von COP1 aus dem Nukleus als auch für die Aktivität von COP1 im Allgemeinen notwendig sind, wohingegen der lichtabhängige Export von SPA1 aus dem Nukleus noch weiter untersucht werden muss. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Kerner, Konstantin kernerkonstantin@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-538709
Date:	21 September 2020
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Botanical Institute
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language plant biology English light signaling English COP1 English SPA1 English Arabidopsis thaliana English
Date of oral exam:	24 November 2020
Referee:	Name Academic Title Hoecker, Ute Prof. Dr. Huelskamp, Martin Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/53870