Universität zu Köln

Klatt, Christoph ORCID: 0000-0002-9740-5375 (2021). Profiling Purification Dependent Sample Composition and Phosphorylation of the CNG Ion Channel. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The flow of ions across the plasma membrane is one of the fundamental processes in living cells. Ion channels aid in regulating the flow of ions along the electrochemical gradient and are essential for sensory signal transduction events. In the retina of the eye, Cyclic Nucleotide Gated (CNG) ion channels are located in rod photoreceptors, where they are crucial for vertebrate vision by producing a dark-current that ceases upon light detection. Unlike most ion channels of the voltage-gated ion channel superfamily, CNG channel cation conductance is primarily activated upon binding of cyclic nucleotides (e.g. cyclic Guanosine Monophosphate). The heterotetrameric CNG channel in bovine rod outer segments comprises three A1 and one B1 subunit. The downregulation of CNG channel activity via the Ca 2+ -dependent Calmodulin (CaM) binding to the B1 subunit is evident, but not all underlying structural mechanisms are understood. Although phosphorylations have been shown to modulate the activity of other related ion channels, only few studies have attempted to investigate potential phosphorylation sites in CNG channels, and information on the phosphorylation of endogenous CNG channels is particularly sparse. We used two orthogonal affinity-based strategies to purify endogenous CNG channels from bovine rod outer segments and performed Mass Spectrometry (MS) to analyse sample composition and localise phosphorylation sites in CNG channels. Moreover, we employed Negative Staining-Electron Microscopy (Negative Staining-EM) to evaluate the purified protein regarding sample quality and structural integrity. We have successfully characterised the purified CNG channels and show subunit composition, stoichiometry, and tetrameric organisation in line with our expectations. Protein identification and quantification in MS-driven analysis revealed distinct protein populations obtained by the two purification strategies, with about a third of proteins unique to either purification strategy. Among the common proteins, we identified several known or suspected interaction partners. The presence of these proteins in relatively high abundance suggests a fraction of CNG channels is purified in a multimeric protein assembly. In addition, we present the first comprehensive phosphorylation analysis of endogenous bovine CNG channels from rod photoreceptors. We observed phosphorylations that may be relevant in the heterotetrameric assembly, interaction with other proteins, and characteristic modulation mechanism of the CNG ion channels.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Der Fluss verschiedener Ionen durch die Zellmembran stellt einen fundamentalen Prozess in lebenden Zellen dar. Ionenkanäle helfen dabei, den Fluss von Ionen entlang des elektrochemischen Gradienten zu regulieren und sind für die Signaltransduktion von wesentlicher Bedeutung. In der Netzhaut des Auges befinden sich die CNG (Cyclic Nucleotide Gated) Ionenkanäle in den Stäbchenzellen und sind dort für das Sehvermögen von Wirbeltieren entscheidend. In der Dunkelheit erlauben die CNG-Kanäle einen kontinuierlichen Einstrom von Kationen, der bei Lichteinfall unterbrochen wird. Entgegen des Großteils der Familienmitglieder spannungsaktivierter Ionenkanäle, werden CNG-Kanäle durch zyklische Nukleotide (z. B. zyklisches Guanosinmonophosphat) für den Einstrom von Kationen geöffnet. Die CNG-Kanäle in den Stäbchenzellen von Rindern sind Heterotetramere und setzen sich aus drei A1- und einer B1-Untereinheit zusammen. Die reduzierte Aktivität des CNG Kanals in Folge der kalziumabhängigen Bindung von Calmodulin an die B1 Untereinheit ist bekannt, aber die zugrunde liegenden strukturellen Mechanismen sind nicht vollständig verstanden. Obwohl gezeigt wurde, dass Phosphorylierungen die Aktivität verwandter Proteine modulieren, thematisieren nur wenige Studien die mögliche Phosphorylierung von CNG- Kanälen und insbesondere für endogene CNG-Kanäle sind Informationen nicht verfügbar. Wir haben zwei orthogonale affinitätsbasierte Strategien verwendet, um CNG-Kanäle aus den Außensegmenten der Stäbchen aufzureinigen. Des Weiteren haben wir Massenspektrometrie (MS) verwendet, um die Zusammensetzung der aufgereinigten Probe zu analysieren und Orte der Phosphorylierung in CNG-Kanälen zu lokalisieren. Außerdem haben wir, unter anderem mit Hilfe der Negativkontrast-Elektronenmikroskopie, das gereinigte Protein im Hinblick auf Probenqualität und strukturelle Integrität evaluiert. Unsere Charakterisierungen zeigen, dass die von uns aufgereinigten CNG-Kanäle unsere Erwartungen an Zusammensetzung, Stöchiometrie und Organisation der Untereinheiten als Tetramer erfüllen. Die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen im Rahmen unserer MS-basierten Analyse ergab zwei charakteristische Proteinpopulationen, die durch die beiden Aufreinigungsstrategien gewonnen wurden, wobei je etwa ein Drittel aller Proteine in nur einer der Aufreinigungsstrategien präsent ist. Unter den gemeinsamen Proteinen finden sich bekannte und mutmaßliche Interaktionspartner von CNG-Kanälen. Die Anwesenheit dieser Proteine in relativ großer Menge deutet darauf hin, dass ein Teil der CNG-Kanäle in einem multimeren Proteinverbund aufgereinigt wird. Darüber hinaus präsentieren wir die erste umfassende Analyse von Phosphorylierungen der endogenen CNG-Kanäle aus Stäbchenzellen der Netzhaut. Wir haben dabei Phosphorylierungen identifiziert, die möglicherweise für den Aufbau des heterotetrameren Ionenkanals, die Interaktion mit anderen Proteinen und den charakteristischen Modulationsmechanismus von Bedeutung sein könnten. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Klatt, Christoph cklatt3@smail.uni-koeln.de orcid.org/0000-0002-9740-5375 UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-545879
Date:	2021
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Cyclic Nucleotide Gated Ion Channel English CNG English Phosphorylation English Mass Spectrometry English Cryo-EM English Structural Biology English
Date of oral exam:	3 December 2021
Referee:	Name Academic Title Behrmann, Elmar Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/54587