Universität zu Köln

Zapilko, Veronika (2013). Identifizierung Ergothionein-haltiger Zellen im Zebrabärbling Danio rerio. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Ergothionein ist eine natürlich vorkommende Aminosäure mit antioxidativen Eigenschaften in vitro. Der Mensch und andere Vertebraten synthetisieren Ergothionein nicht selbst, sondern können es nur über die Nahrung aufnehmen. Die physiologische Funktion von Ergothionein ist unbekannt. Cytoplasmamembranen sind für das hydrophile Ergothionein undurchlässig. Der Transport von Ergothionein in das Cytosol wird von einem hochspezifischen Transporter in der Plasmamembran, dem Ergothionein-Transporter, durchgeführt. Der Ergothionein-Transporter stellt den bis jetzt einzigen Biomarker für eine mögliche Ergothionein-Akkumulation/Aktivität dar. Beim Menschen bewirkt dieser Transporter (Gensymbol SLC22A4) eine Anreicherung von Ergothionein z. B. in Vorläuferzellen der Erythrozyten, in Monozyten und daher vermutlich auch in Makrophagen, die aus Monozyten hervorgehen. Monozyten und Makrophagen sind an chronischen Entzündungsprozessen beteiligt. Dies deutet auf eine Rolle von Ergothionein im Immunsystem hin, wofür auch spricht, dass das Auftreten der chronischen Entzündungserkrankungen Morbus Crohn, Colitis ulcerosa und rheumatoide Arthritis mit Varianten des Transportergens in Verbindung gebracht wurden. Ergothionein könnte daher möglicherweise in der Zukunft als neuer Wirkstoff bei der Prophylaxe oder bei der Therapie dieser Krankheiten zum Einsatz kommen. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, den Zebrabärbling Danio rerio als Modellorganismus für die Untersuchung der physiologischen Funktion von Ergothionein zu etablieren. Hierfür ist es essentiell, die exakten Funktionsorte von Ergothionein zu bestimmen. Daher sollte hier ein Werkzeug zur Identifizierung Ergothionein-haltiger Zellen mit Einzelzellauflösung im Zebrabärbling entwickelt werden. Zu diesem Zweck wurde die Herstellung einer transgenen Reporterlinie angestrebt, in der die Expression des grün-fluoreszierenden Proteins eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) unter Promotor-Kontrolle des Ergothionein-Transporters steht. Trotz umfassender Bemühungen war es jedoch nicht möglich, eine Zebrabärblinglinie mit einem eGFP-Expressionsprofil, das dem des Transportergens (slc22a4) entspricht, zu etablieren. Möglicherweise wird die slc22a4-Transkription von weit entfernt liegenden cis-regulatorischen Elementen beeinflusst, die hier nicht identifiziert werden konnten. Als Alternative wurde endogener Ergothionein-Transporter immunhistochemisch nachgewiesen. Hierzu wurden polyklonale Antikörper hergestellt, deren Spezifität mittels heterologer Expression gezeigt werden konnte. Der Slc22a4 Transporter konnte mit diesen Antikörpern in den Bürstensäumen von Darm und Niere nachgewiesen werden, in denen Slc22a4 vermutlich die Aufgabe der Ergothionein-Absorption und Ergothionein-Retention übernimmt. Zudem konnten in der Retina einzelne Zellschichten als Wirkungsorte von Ergothionein plausibel gemacht werden. Demgegenüber konnte der Transporter in Haut und Gehirn nicht immunhistochemisch nachgewiesen werden, obwohl sowohl Ergothionein als auch slc22a4-mRNS in beiden Organen in hohem Maße vorhanden sind. Es wäre denkbar, dass die Epitope des Slc22a4 in der Haut und im Gehirn maskiert sind. Als weitere Methode zur Lokalisierung des Slc22a4 Transporters wurde RT-PCR eingesetzt. Hierbei konnten Transkripte in peripheren Blutzellen des Zebrabärblings nachgewiesen werden. Die genaue Identität der slc22a4-positiven Zellen kann nun immunhistochemisch festgestellt werden. Falls wie beim Menschen der Ergothionein-Transporter in Monozyten und Makrophagen vorhanden ist, könnten die Folgen eines Ergothionein-Mangels im Immunsystem dann im Zebrabärbling untersucht werden. Damit kämen dann die weitreichenden experimentellen Vorteile des Zebrabärblings zum Tragen.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Ergothioneine is a naturally occurring amino acid with antioxidative properties in vitro. Humans and other vertebrates do not synthesise ergothioneine themselves and must absorb it through their diet. The physiological function of ergothioneine is unknown and cytoplasm membranes are impermeable to the hydrophilic ergothioneine. Ergothioneine is transported into the cytosol by a highly specific transporter in the plasma membrane, the ergothioneine transporter. The ergothioneine transporter represents the only current biomarker for possible ergothioneine accumulation/activity. In humans this transporter (gene symbol SLC22A4) causes an accumulation of ergothioneine, e.g., in erythrocyte progenitor cells, in monocytes and therefore presumably also in macrophages, which develop from monocytes. Monocytes and macrophages are involved in chronic, inflammatory processes. This indicates that ergothioneine has a role in the immune system, which is supported by the fact that the occurrence of the chronic inflammatory diseases Crohn's disease, colitis ulcerosa and rheumatoid arthritis has been linked to variants of the transporter gene. Ergothioneine could therefore possibly have future application as a new drug in the prevention or treatment of these diseases. The aim of this doctoral thesis was to establish the zebrafish Danio rerio as a model organism for the investigation of the physiological function of ergothioneine. This requires the exact place of function of ergothioneine, so it was intended to develop a tool for the identification of cells containing ergothioneine in zebrafish, with single-cell resolution. It was aimed to produce a transgenic reporter line in which the expression of the green fluorescent protein eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) is under promoter control of the ergothioneine transporter. However, despite extensive effort it was not possible to establish a zebrafish line with an eGFP-expression profile that corresponds to that of the transporter gene (slc22a4). It is possible that slc22a4-transcription is affected by distant cis-regulatory elements, which were not to identified here. As an alternative, immunohistochemistry was used to show the presence of endogenous ergothioneine transporter. This involved the production of polyclonal antibodies and their specificity was shown by heterologous expression. These antibodies were used to show the presence of the Slc22a4 transporter in the brush borders of the intestines and kidneys, in which Slc22a4 presumably takes over the tasks of ergothioneine absorption and ergothioneine retention. In addition, it was possible to plausibly show individual cell layers in the retina as effective areas of ergothioneine. In contrast, it was not possible to show evidence of the transporter in the skin and brain using histochemistry, although both ergothioneine and slc22a4-mRNS are present in both organs in large quantities. It is possible that the epitopes of Slc22a4 are masked in the skin and brain. RT-PCR was employed as a further method for the localisation of the Slc22a4 transporter. This showed the presence of transcripts in the peripheral blood cells of the zebrafish. It is now possible to positively identify slc22a4-positive cells using immunohistochemistry. If, as in humans, the ergothioneine transporter is present in monocytes and macrophages, it would be possible to examine the consequences of ergothioneine deficiency in the immune system in zebrafish. This would make use of the extensive experimental advantages of zebrafish. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Zapilko, Veronika v.zapilko@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-54632
Date:	25 September 2013
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Ergothionein UNSPECIFIED Zebrabärbling UNSPECIFIED
Date of oral exam:	16 October 2013
Referee:	Name Academic Title Korsching, Sigrun Prof. Dr. Hammerschmidt, Matthias Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5463