Universität zu Köln

Uthoff, Matthias ORCID: 0000-0002-6477-5505 (2022). Chloride dependent regulation of osmolyte producing GgpS and Remodelling of the substrate translocating loop by ADP release in AAA+ protease FtsH. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Glucosylglycerol-phosphate synthase (GgpS) is one of the two enzymes required for the production of glucosylglycerol, the main compatible solute in the cyanobacterium Synechocystis sp. These compounds are essential for halotolerance and as such are osmotic active but highly compatible with the metabolism, i.e. they are protein stabilising. Glucosylglycerol and other compatible solutes are commercialised in various pharma but especially in cosmetic products for skin ‘revitalisation’ and as hydrating agents. GgpS is a glycosyltransferase catalysing the reaction of ADP-glucose and glycerol-3-phosphate to ADP and glucosylglycerol-phosphate under retention of the stereoisomerism of the anomeric carbon. GgpS was found to be constitutively expressed but inactive under low salt conditions and strongly expressed and activated if the cells are shocked with medium containing high salt concentrations. Previously, inactivation was thought to be realised by binding of GgpS to DNA and thought to be activated due to electrostatic shielding of GgpS from the nucleic acid by the salt ions. Here I will present the first 3D-structure of GgpS a glycosyltransferase with the common B fold. Surprisingly, two chloride anions are bound to the tetrameric enzyme and imply a so far unknown direct chloride dependence of GgpS. I could indeed validate the effect of chloride on the enzymatic activity by comparison of the wild type with a binding deficient mutant. This effect probably has been missed due to or mixed up with an Mg2+-dependency. The Mg2+ cation in previous studies has always been added in the form of MgCl2. Additionally, I demonstrate the importance of chloride binding for DNA inhibition rescue and give first predictions of the GgpS:DNA complex. Another project discussed here is about the AAA+ protease FtsH. AAA+ proteins are known for their hexameric ring structure and the ability to translocate proteins or nucleic acids through the central pore. Translocation unfolds 3D structures, and hence AAA+ pro¬teins are found where unfolding, potentially prior to correct refold¬ing (chaperone for proteins), or where just the movement along a substrate (helicases for nucleic acids) is required. Investigation of the translocation mechanism is currently accelerated by the emerging method of cryo-electron microscopy. In AAA+ proteases, another ring with proteolytic activity enables these complexes to completely degrade tightly folded proteins. Hence, they ensure protein quality control in all cells and recycling of their amino acids. FtsH is one of the simplest members of this family of proteins as its hexamer is constituted by just six identical proteins. However, it is simultaneously the only membrane bound AAA+ protease in bacteria, mitochondria and plastids. During my master’s thesis (2015), I started crystallising a new construct of FtsH from Aquifex aeolicus lacking the N terminal trans-membrane and periplasmic part. I described a new conformation of the usually substrate-engaging ‘pore loop’ which I believe is required for correct subunit movement after translocation (Uthoff & Baumann, 2018). To validate critical residues, I pre¬sent here the development of three activity assays. In addition, we started a collaboration with Elmar Behrmann and I will present here the first full-length structure of FtsH solubilised in detergents at around 6 Å. However, cryo-electron microscopy with membrane proteins is challenging and the work is ongoing. A very promising dataset for a higher resolution structure is currently being processed.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Glukosylglycerin-Phosphat Synthase (GgpS) ist eines der beiden Enzyme, die beteiligt sind an der Darstellung von Glukosylglycerin, dem wichtigsten kompatiblen Solut im Cyano-bak¬terium Synechocystis sp. Verbindungen dieserart sind osmo-tisch aktiv, dienen damit der Halotoleranz und sind deswegen zugleich in hohem Maße kompatibel mit dem Metabolismus, d.h. vorranging Protein stabilisierend. Glukosylglycerin und andere kompatible Solute werden in verschiedenen Pharmazeutika, insbesondere aber in kosmetischen Produkten zur „Revita¬lisie-rung“ oder Hydratisierung der Haut eingesetzt. GgpS ist eine Glyko¬syl¬trans¬ferase, die die Reaktion von ADP-Glukose und Glyce-ryl-3-phosphat zu ADP und Glukosylglycerin-phosphat unter Beibehaltung der Stereoisomerie des anomeren Kohlenstoffs katalysiert. Frühere Veröffentlichungen berichten, dass GgpS unter Bedingungen mit niedrigem Salzgehalt inaktiv ist, aber konstitutiv exprimiert wird; hingegen jedoch aktiviert und stärker exprimiert wird nach dem Umsetzen in Medium mit hohem Salzgehalt. Bisher wurde angenommen, dass die Inaktivierung durch Bindung an DNA realisiert ist: Erst durch einen intrazellulären Salz-Schock werden GgpS und die Nukleinsäure voneinander getrennt. Die Salzionen schirmen dabei beide Bindungspartner elektrostatischen voneinander ab. Im Folgenden werde ich die erste Struktur von GgpS, einer Glyko¬syltransferase mit der bekannten B-Faltung, vorstellen. Überra¬schen¬der¬weise sind zwei Chlorid-Anionen an das konstituierte Tetramer gebunden und implizieren damit eine bislang unbekannte direkte Chlorid-Abhängigkeit von GgpS. In der Tat konnte ich einen Effekt von Chlorid auf die Aktivität validieren u.a. durch einen Vergleich mit einer Mutante die kein Chlorid an der spezifizierten Stelle mehr binden kann. Dieser Effekt könnte in der Vergangenheit entweder übersehen oder gar verwechselt worden sein mit einer Mg2+-Abhängigkeit. Das Mg2+ war immer als Chlorid-Salz hinzu-gefügt worden. Zusätzlich zeige ich die Bedeutung der Chlorid-Bindung für die Reaktivierung nach DNA-Hemmung und gebe erste Vorhersagen über den GgpS:DNA-Komplex. Ein weiteres hier diskutiertes Projekt befasst sich mit der AAA+ Protease FtsH. AAA+ Proteine sind bekannt für ihre hexamere Ringstruktur und die Fähigkeit, Proteine oder Nukleinsäuren durch die gebildete Pore zu translozieren. Die Translokation entfaltet Strukturen und daher lassen sich AAA+ Proteine dort finden, wo eine Entfaltung, möglicherweise vor einer korrekten Rückfaltung (Chaperone für Proteine), oder auch nur eine Bewegung entlang eines Substrats (Helikasen für Nukleinsäuren) erforderlich ist. Die Untersuchung des Translokationsmechanismus wird derzeit durch die aufkommende Methode der Kryo-Elektronenmikroskopie be¬schleu¬nigt. Bei AAA+ Proteasen ermöglicht ein weiterer Ring mit proteolytischer Aktivität einen vollständigen Abbau der ehemals stark gefalteten Proteine. Diese Proteasen gewährleisten daher die Kontrolle der Proteinqualität in allen Zellen und das Recycling ihrer Aminosäuren. FtsH ist eines der einfachsten Mitglieder dieser Proteinfamilie, da sein Hexamer nur aus sechs identischen Proteinen besteht. Es ist jedoch gleichzeitig die einzige membran-gebundene AAA+ Protease. Während meiner Masterarbeit (2015) begann ich ein neues Konstrukt aus Aquifex aeolicus ohne Membranteil zu kristallisieren. Die verfeinerte und nun gründlich analysierte Struktur wurde schließlich im Jahr 2018 veröffentlicht (Uthoff & Baumann, 2018). Ich beschrieb eine neue Faltung der „pore loop“, welche normalerweise mit dem Substrat während der Translokation interagiert. Die alternative Faltung ist meiner Meinung nach für die korrekte Rückbewegung der Untereinheit nach der Translo¬kation erforderlich. Um für den Mechanismus kritische Amino¬säure zu validieren, entwickelte ich drei Aktivitäts¬assays welche ich ebenfalls hier vorstelle. Darüber hinaus haben wir eine Zusammenarbeit mit Elmar Behrmann begonnen und präsentieren die erste Struktur von volllängen-FtsH in Detergenz, die bei etwa 6 Å aufgelöst ist. Kryo-Elektronen-mikroskopie mit Membranpro¬teinen ist jedoch eine Herausfor-derung und die Arbeiten dauern an. Ein vielversprechender Daten-satz für ein Modell mit höherer Auflösung wird derzeit prozessiert. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Uthoff, Matthias matthias.uthoff@alumni.uni-koeln.de orcid.org/0000-0002-6477-5505 UNSPECIFIED
Contributors:	Contribution Name Email Censor Baumann, Ulrich ulrich.baumann@uni-koeln.de Censor Hofmann, Kay Kay.Hofmann@uni-koeln.de
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-546463
Date:	1 February 2022
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Chemistry and allied sciences Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language GgpS, chloride interaction, FtsH, pore loop, structural biology English
Date of oral exam:	18 February 2021
Referee:	Name Academic Title Baumann, Ulrich Prof. Dr. Hofmann, Kay Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/54646