Universität zu Köln

Ramasubramanian, Selva Kumari (2012). Biochemical and Structural Characterization of RCR3-AVR2: A Model for Protease-Inhibitor Interactions at the Plant-Pathogen Interface. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The tomato apoplast is a molecular battle ground for proteases and inhibitors during plant-pathogen interactions. The interaction between structurally diverse pathogen-derived inhibitors (EPIC1, EPIC2B, AVR2 and RIP1) and their target proteases (RCR3, PIP1 and C14) is an ideal system to study molecular arms-races. First we generated a collection of 52 isoforms of proteases and inhibitors in the pFLAG-ATS expression vector for expression in Escherichia coli. We summarise the expression of both the proteases and inhibitors and show that the inhibitor proteins were produced successfully, unlike the proteases. Second we expressed and purified AVR2 on a large scale and show that purified AVR2 is capable of inhibiting RCR3 and triggering the Cf2-mediated hypersensitive response (HR) in tomato demonstrating that recombinant AVR2 is functional. We next implement biophysical and structural biology tools to elucidate the secondary and tertiary structure of AVR2. The major findings are that: (i) AVR2 is a beta protein determined by circular dichroism (CD) (ii) At apoplastic pH, AVR2 exerts a conformational change associated with RCR3 inhibition determined by CD and tyrosine fluorescent spectroscopy (iii) AVR2 is a potent inhibitor of papain determined by enzyme assay using BODIPY FL casein. Attempts to crystallize AVR2 with and without epitope tags and at different concentrations and conditions failed, possibly because AVR2 is a heavily charged basic protein. Next all 13 lysines and the N-terminus of epitope-tagged AVR2 were methylated but no crystals were obtained. This methylated AVR2 still triggers HR in Cf2 tomato plants. Preliminary NMR experiments of non-methylated AVR2 showed good resolution for future structure elucidation of AVR2. Third, we tested four different heterologous expression systems (plant, bacterium, insect and yeast) to generate high quantities of active and soluble RCR3. We conclude that yeast is the best expression system to produce high amounts of soluble proRCR3 and proRCR3 is fully converted into mature RCR3 in the presence of reducing agents and acidic pH buffer. Finally, we study the role of double cysteine (Cys24, Cys25) in the catalytic site of RCR3 which is common to PLCP subclass 6 of plant PLCPs. Using agroinfiltration in Nicotiana benthamiana we produced C24A, C25A and C24AC25A mutant RCR3 proteins and we discovered that (i) Cys25 but not Cys24 is the essential catalytic residue labelled by activity-based probe MV201. (ii) Surprisingly maturation of RCR3 does not require the catalytic Cys25, indicating that other endogeneous proteases activate RCR3. (iii) Proteolytically inactive RCR3 mutants triggers Cf-2-mediated HR in the presence of AVR2 and (iv) Interestingly, ascorbate enhances the activity of the C24A mutant but not wild-type RCR3, suggesting that Cys24 in RCR3 might have a role in sensing redox potential. The autocatalytic activation of proRCR3 produced in yeast combined with the maturation of the C25A mutant inplanta suggests that RCR3 can be activated by both intramolecular and intermolecular processing.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Während einer Infektion wird der Interzellularraum (Apoplast) einer Tomatenpflanze zum Kampfplatz zwischen Proteasen und deren Inhibitoren. Die Interaktion zwischen strukturell diversen Inhibitoren, die vom Pathogen sekretiert werden (EPIC1, EPIC2B, AVR2 und RIP1) und deren Zielmolekülen, wirtseigene Proteasen wie RCR3, PIP1 und C14, sind ein ideales Modellsystem um das molekulare Wettrüsten zwischen Wirt und Pathogen zu untersuchen. Für diese Studie haben wir zunächst einen Datensatz bestehend aus insgesamt 52 Isoformen dieser Proteasen und deren Inhibitoren im pFLAG-ATS Expressions system, das zur Expression von Proteinen in Escherichia coli geeignet ist, erstellt. In dieser Arbeit fassen wir die Ergebnisse dieser Expressionstudie sowohl der Proteasen als auch der Inhibitoren zusammen und zeigen, dass die Inhibitoren erfolgreich exprimiert und sekretiert werden konnten, die Proteasen dagegen nicht. Desweiteren haben wir AVR2 im großen Maße exprimiert und aufgereinigt und zeigen, dass unser aufgereinigtes AVR2 ein aktiver Inhibitor ist, da es dazu in der Lage ist, RCR3 zu hemmen und die hypersensitive Immunantwort (HR) in Tomaten zu aktivieren. Im Weiteren untersuchen wir die Sekundär- und Tertiärstruktur von AVR2 mit Hilfe von biophysikalischen und strukturbiologischen Methoden. Unsere wichtigsten Ergebnisse zeigen, dass: (i) AVR2 ein Betaprotein ist (gemessen durch Zirkulardichroismus (CD)), (ii) AVR2 bei apoplastischem pH eine Konformationsänderung auslöst, die mit der Hemmung von RCR3 assoziiert ist (ebenfalls gemessen durch CD) und (iii) AVR2 ein wirksamer Inhibitor von Papain ist, was durch enzymatische Analysen mit BODIPY FL Casein untersucht wurde. Es wurden verschiedene Versuche durchgeführt, AVR2 mit oder ohne Epitopenmarkierung und unter verschiedenen Ausgangskonditionen sowie in verschiedenen Konzentrationen zu kristallisieren. Diese Versuche waren jedoch nicht erfolgreich – vermutlich weil AVR2 ein stark geladenes, basisches Protein ist. Auch Methylierung sämtlicher 13 Lysine sowie des N-Terminus von epitopenmarkiertem AVR2 konnte keine Kristallisierung auslösen. Methyliertes AVR2 ist jedoch immer noch in der Lage, in Tomatenpflanzen, die Cf2 besitzen, eine Immunreaktion hervorzurufen. Erste Ergebnisse einer Kernspinresonanzspektroskopie mit unmethyliertem AVR2 erzielten eine gute Auflösung und begründen eine gute Ausgangsposition für zukünftige Strukturanalysen mit AVR2. Im Folgenden wurden verschiedene heterologe Expressionssysteme (Pflanze, Bakterium, Insekt und Hefe) getestet, um eine möglichst effiziente Expression von aktivem und löslichem proRCR3 zu erreichen. proRCR3 wird bei saurem pH und in der Gegenwart von Reduktionsmitteln zur Gänze in reifes und funktionsfähiges RCR3 umgewandelt. Schließlich untersuchen wir die Rolle des Doppelcysteins im katalytischen Zentrum von RCR3, welches der Unterklasse 6 innerhalb der pflanzlichen papainartigen Cysteinproteasen (PLCPs) gemein ist. Mit Hilfe von Agrobakterium-vermittelter, instabiler Transformation von Nicotiana benthamiana haben wir folgende RCR3-Varianten produziert: C24A, C25A und C24AC25A. Mit Hilfe dieser Varianten konnten wir herausfinden, dass (i) Cys25 nicht aber Cys24 die essentielle, katalytische Aminosäure ist, die durch die aktivitätsbasierende Sonde MV201 markiert wird, (ii) zum Reifungsprozess von RCR3 überraschenderweise das katalytische Cys25 nicht benötigt wird, was dadurch zu erklären ist, dass andere endogene Proteasen RCR3 aktivieren, (iii) proteolytisch inaktive RCR3-Varianten eine Cf2 vermittelte Immunantwort auslösen können und (iv) Ascorbat interessanterweise die Aktivität der C24A-Variante, nicht aber von Wildtyp-RCR3 erhöht, was darauf schließen lässt, dass Cys24 eine Rolle bei der Detektion des Redoxpotentials spielt. Die autokatalytische Aktivierung von in Hefe produziertem proRCR3 zusammen mit dem Reifungsprozess der C25A-Variante in planta deuten darauf hin, dass RCR3 durch intra- sowie intermolekulare Prozessierung aktiviert werden kann. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Ramasubramanian, Selva Kumari raagha85@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Contributors:	Contribution Name Email Collaborator Mohammed, Shabab mshabab@ice.mpg.de Collaborator Hörger, Anja hoerger@mpipz.mpg.de Collaborator Muhammad, Ilyas ilyas@mpipz.mpg.de Collaborator Wu, Boqian Boqian.Wu@carlsberglab.dk Collaborator Ubbink, Marcellus m.ubbink@chem.leidenuniv.nl Collaborator Rose, Rolf Rolf.Rose@cgc.mpg.de Collaborator Jaskolski, Mariusz mariuszj@amu.edu.pl Author in quotations or text extracts A. L. van der Hoorn, Renier renier.vanderhoorn@plants.ox.ac.uk
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-54715
Date:	5 May 2012
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Protease UNSPECIFIED Inhibitors UNSPECIFIED Plant Pathogen UNSPECIFIED RCR3 UNSPECIFIED AVR2 UNSPECIFIED Papain-like-cysteine proteases UNSPECIFIED PLCPs UNSPECIFIED ABPP, DCG04, Bodipy UNSPECIFIED EPIC1, EPIC 2B , RIP1 UNSPECIFIED C14, PIP1 UNSPECIFIED Structural Biology UNSPECIFIED Crystallography UNSPECIFIED Inhibition assay, activity, enzyme kinetics UNSPECIFIED
Date of oral exam:	22 June 2012
Referee:	Name Academic Title Schulze-Lefert, Paul Prof. Dr. Fluegge, Ulf-Ingo Prof. Dr. Bucher, Marcel Prof. Dr. Doehlemann, Gunther Dr.
Funders:	International Max Planck Research School
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5471