Roenneke, Benjamin Michael Emil (2014). Die Glukosylglycerolphosphatsynthase aus dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803: Mechanismus der Aktivitätsregulation. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Kurzzusammenfassung Die Glukosylglycerolphosphatsynthase (GgpS) ist das Schlüsselenzym bei der Synthese des kompatiblen Soluts Glukosylglycerol bei hyperosmotischem Stress im Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Die GgpS wird postranslational reguliert. Sie bindet unter Niedrigsalzbedingungen an Nukleinsäuren und wird dadurch inaktiviert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dieser Inhibitionsmechanismus näher untersucht und mehrere Glukosyltransferasen hinsichtlich ihrer Interaktion mit Nukleinsäuren analysiert. Es wurde gezeigt, dass die GgpS über eine nicht kompetitive Hemmung reguliert wird. Dabei weist die GgpS eine sehr hohe Affinität zu Nukleinsäuren auf, was über die Messung der Lichtstreuung und Tryptophanfluoreszenz des Proteins gemessen werden konnte. Die Inhibition durch Nukleinsäuren konnte bei einer GgpS aus einem weiteren Organismus gezeigt werden. Hierbei handelte es sich um die GgpS aus Synechococcus sp. 7002. Bei Glukosyltransferasen aus weiteren Organismen konnte eine Interaktion mit Nukleinsäuren gezeigt werden, jedoch wurde keine Inhibition beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die GgpS oligomere Komplexe ausbildet. Es handelt sich dabei mit hoher Wahrscheinlichkeit um Homotetramere. Der Oligomerisierungsstatus verändert sich nicht während der Interaktion mit Nukleinsäuren oder durch den Einfluss von Ionen. Die Interaktion der GgpS mit Nukleinsäuren findet über eine elektrostatische Wechselwirkung von positiv geladenen Aminosäuren mit dem negativ geladenen Rückgrat der Nukleinsäuren statt. In dieser Arbeit wurden Aminosäurereste gefunden, die an der Interaktion mit Nukleinsäuren beteiligt sein könnten. Dies geschah über die Analyse von GgpS-Varianten, bei denen einzelne positiv geladene Aminosäuren entfernt und durch Alanine ersetzt wurden. Hinweise über die zu analysierenden Aminosäuren lieferte die Untersuchung der GgpS aus Synechococcus sp. WH8102, welche nicht an Nukleinsäuren bindet und die an den putativen Nukleinäureinteraktionsstellen der Synechocystis GgpS keine positiven Aminosäurereste trägt. Mehrere GgpS Varianten zeigten eine schwächere Nukeleinsäurebindung und wurden nur noch schwach durch Nukleinsäuren inhibiert, was Hinweise über die Lokalisierung der Interaktionsstellen lieferte. Neben den Untersuchungen des Inhibitionsmechanismus der GgpS wurde die Regulation des Proteins in einem heterologen in vivo System analysiert. Die GgpS ist in Corynebacterium glutamicum aktiv und wird auch wie in Synechocystis reguliert. Dies stellt einen weiteren deutlichen Nachweis der GgpS Inhibition durch die eine sequenzunspezifische Interaktion mit Nukleinsäuren bei Niedrigsalzbedingungen dar. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine hohe GG-Synthese in diesem Bakterienstamm stattfindet, was zu einer Entwicklung eines GG Produktionsstammes von C. glutamicum führte.

Item Type: Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:
AbstractLanguage
Abstract The glucosylglycerolphosphatsynthase (GgpS) is the key enzyme in the synthesis of the compatible solute glucosylglycerol in response to hyperosmotic stress in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. The GgpS is mainly regulated at the posttranslational level. The enzyme binds at low salt concentrations to nucleic acids and becomes inactivated. The inhibition mechanism was investigated in more detail during this thesis. The interaction of glucosyltransferases with nucleic acids was investigated. It was shown that GgpS is regulated via a non competitive inhibition mechanism. GgpS has a very high affinity to nucleic acids, which was shown via measurement of light scattering and tryptophan fluorescence. Inhibition by nucleic acids was shown for the GgpS protein from Synechococcus sp. 7002. GgpS forms homotetrameric complexes. The oligomerisation state is not changing upon interaction with nucleic acids or NaCl. Positively charged amino acid residues of the GgpS interact electrostatically with the negatively charged backbone of the nucleic acid. Amino acid residues involved in the interaction were found in this thesis. This was achieved by the exchange of positively charged amino acids for alanine residues. Important hints for putative target amino acids were also provided by results of the analysis of GgpS from Synechococcus sp. WH8102. This GgpS protein did not bind to nucleic acids, since amino acids which could be involved in nucleic acid binding by GgpS from Synechocystis are not present in the Synechococcus GgpS. Several tested GgpS variants have shown a weaker nucleic acid binding and the inhibition was impaired. Besides analysis of the inhibition mechanism of GgpS, regulation of the enzyme was analysed in a heterologous in vivo system. It could be shown, that GgpS is active and regulated in Corynebacterium glutamicum like in Synechocystis. This proves a sequence unspecific inhibition of the protein by nucleic acids under low salt concentrations. In this system a high GG synthesis rate was detected. These results led to the development of a C. glutamicum GG production strain.English
Creators:
CreatorsEmailORCIDORCID Put Code
Roenneke, Benjamin Michael Emilbenjamin.roenneke@gmail.comUNSPECIFIEDUNSPECIFIED
URN: urn:nbn:de:hbz:38-54886
Date: 2014
Language: German
Faculty: Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions: Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects: Chemistry and allied sciences
Life sciences
Uncontrolled Keywords:
KeywordsLanguage
Synechocystis, Glukosylglycerolphosphatsynthase, osmotischer Stress, kompatible Solute, AktivitätsregulationUNSPECIFIED
Date of oral exam: 23 January 2014
Referee:
NameAcademic Title
Krämer, ReinhardProf. Dr.
Flügge, Ulf-IngoProf. Dr.
Refereed: Yes
URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5488

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