Universität zu Köln

Heß, Sarah Aurora (2022). Eine Strategie zur STR-Analyse telogener Einzelhaare in der forensischen Genetik. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Telogene Einzelhaare sind häufig vorkommende Spurentypen an Tatorten. Derzeit werden sie zumeist von der STR-Typisierung ausgeschlossen, weil ihre STR-Profile aufgrund geringer DNA-Mengen und starker DNA-Degradierung in vielen Fällen unvollständig und schwierig zu interpretieren sind. In der vorliegenden Arbeit wurde eine systematische Vorgehensweise angewandt, um Korrelationen zwischen der DNA-Menge und DNA-Degradierung zu dem Erfolg der STR-Typisierung aufzuweisen und darauf basierend den Typisierungs-Erfolg von DNA aus Haaren vorhersagen zu können. Zu diesem Zweck wurde ein human- (RiboD) und ein canin-spezifischer (RiboDog) qPCR-basierter Assay zur Messung der DNA-Menge und Bewertung der DNA-Integrität mittels eines Degradierungswerts (D-Wert) entwickelt. Aufgrund der Lage der genutzten Primer, welche auf ubiquitär vorkommende ribosomale DNA-Sequenzen abzielen, ist das Funktionsprinzip schnell und kostengünstig auf unterschiedliche Spezies anzuwenden. Die Funktionsweise der Assays wurde mittels seriell degradierter DNA bestätigt und der humane Assay wurde im Vergleich zum kommerziellen Quantifiler® Trio DNA Quantification Kit validiert. Schließlich wurde mit den Assays an DNA aus telogenen und katagenen Einzelhaaren von Menschen und Hunden der Zusammenhang zwischen DNA-Menge und DNA-Integrität zu der Vollständigkeit der STR-Allele (Allel Recovery) von DNA-Profilen untersucht, die mittels kapillarelektrophoretischer (CE) STR-Kits erhaltenen wurde. Es zeigte sich, dass bei humanen Einzelhaaren die Allel-Recovery sowohl von der DNA-Menge als auch der DNA-Integrität abhängt. Dagegen war die DNA-Degradierung bei einzelnen Hundehaaren durchweg geringer und die Allel-Recovery hing allein von der extrahierten DNA-Menge ab. Um die STR-Analytik degradierter humaner DNA-Proben weiter zu verbessern, wurde ein neuartiger NGS-basierter Assay (maSTR, Mini-Amplikon-STR) etabliert, der die 16 forensischen STR-Loci des European Standard Sets und Amelogenin als sehr kurze Amplikons (76-296 bp) parallel amplifiziert. Mit intakter DNA generierte der maSTR-Assay im Mengenbereich von 200 pg eingesetzter DNA reproduzierbare, vollständige Profile ohne Allelic Drop-ins. Bei niedrigeren DNA-Mengen traten vereinzelt Allelic Drop-ins auf, wobei unter Verwendung von mindestens 43 pg DNA vollständige Profile erhalten wurden. Die kombinierte Strategie aus RiboD-Messungen der DNA-Menge und -Integrität und daraus resultierendem STR-Typisierungserfolg des maSTR-Assays wurde an degradierter DNA validiert. Anschließend wurde die Strategie auf DNA aus telogenen und katagenen Einzelhaaren angewandt und mit den Ergebnissen des CE-basierten PowerPlex® ESX 17-Kits verglichen, das dasselbe STR-Marker-Set analysiert. Dabei zeigte sich, dass der Erfolg der STR-Typisierung beider STR-Assays sowohl von der optimalen Menge der Template-DNA als auch von der DNA-Integrität abhängt. Mit dem maSTR-Assay wurden vollständige Profile mit ungefähr 50 pg Input-DNA für leicht degradierte DNA aus Einzelhaaren nachgewiesen, sowie mit ungefähr 500 pg stark degradierter DNA. Aufgrund der geringen DNA-Mengen von telogenen Einzelhaaren schwankte die Reproduzierbarkeit der maSTR-Ergebnisse, war jedoch stets dem PowerPlex® ESX 17-Kit in Bezug auf die Allel-Recovery überlegen. Ein Vergleich mit zwei, hinsichtlich der Längenverteilung der Amplikons komplementären CE-basierten STR-Kits (PowerPlex® ESX 17 und ESI 17 Fast), sowie mit einem kommerziellen NGS-Kit (ForenSeq™ DNA Signature Prep) ergab, dass nicht die Technik der NGS, sondern die Kürze der Amplikons der wichtigste Faktor zur Typisierung degradierter DNA ist. Der maSTR-Assay wies in allen Vergleichen mit den genutzten kommerziellen Kits jedoch eine höhere Anzahl an Allelic Drop-ins auf. Diese traten umso häufiger auf, je geringer die verwendete DNA-Menge und je stärker degradiert diese war. Weil Profile mit Allelic Drop-ins Mischprofilen entsprechen, wurden die per maSTR-Assay generierten STR-Profile mit Verfahren zur Interpretation von Mischspuren untersucht. Bei der Composite-Interpretation werden alle vorkommenden Allele von Replikaten gezählt, bei der Consensus-Interpretation lediglich die reproduzierbaren Allele. Dabei stellte sich heraus, dass im Fall von wenigen Allelic Drop-ins (PowerPlex® ESX 17-generierte Profile) die Composite-Interpretation und bei Allelic Drop-in-haltigen Profilen (maSTR-generierte Profile) die Consensus-Interpretation am besten geeignet ist. Schließlich wurde mittels der GenoProof Mixture 3-Software untersucht, inwieweit semi- und vollständig kontinuierliche probabilistische Verfahren bei der biostatistischen Bewertung der DNA-Profile aus Einzelhaaren geeignet sind. Dabei zeigte sich, dass der maSTR-Assay aufgrund der hohen Anzahl an Allelic Drop-ins den CE-basierten Methoden nur in Fällen von DNA leicht überlegen ist, die in ausreichender Menge und gering degradiert vorliegt. In diesem Bereich gelingt die Zuordnung des Profils aus Haaren zum Referenzprofil jedoch ebenfalls mittels CE-basierten Methoden. Aus allen Ergebnissen wurde eine Empfehlung für die Handhabung von DNA aus ausgefallenen Einzelhaaren abgeleitet, die auf dem DNA-Degradierungsgrad in Kombination mit der DNA-Menge basiert. Die vorliegende Arbeit schafft somit eine Grundlage, um ausgefallene Einzelhaare in der Routine-Arbeit von kriminaltechnischen Ermittlungen nutzbar zu machen, sowie gegebenenfalls auf andere Spurentypen mit degradierter DNA geringer Menge anzuwenden. Dadurch könnte die Nutzbarkeit solcher Spurentypen für die forensische Kriminalistik erhöht werden, insbesondere wenn die standardmäßig verwendeten CE-basierten Methoden versagen. Perspektivisch ist die Technik der NGS aufgrund der großen Multiplexierbarkeit uniformer, kurzer Marker generell der CE-basierten Technik bei der Typisierung degradierter DNA überlegen.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Heß, Sarah Aurora sarahaurohess@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-555200
Date:	2 February 2022
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Cologne Center for Genomics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language STR German
Date of oral exam:	2 February 2022
Referee:	Name Academic Title Nürnberg, Peter Prof., Dr. rer. nat.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/55520