Universität zu Köln

Herwartz, Christine (2014). Charakterisierung des Transkriptionsfaktors ZNF395/PBF im Rahmen der angeborenen Immunantwort. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Genomweite Expressionsanalysen fanden eine erhöhte Expression des bisher wenig charakterisierten Transkriptionsfaktors ZNF395 in verschiedenen Krebsarten, u.a. im Rahmen einer Antwort des Tumors auf Hypoxie. Ein Mikroarray offenbarte, dass ZNF395 die Expression einer kleinen Gruppe Krebs-assoziierter Gene aktivierte, sowie einiger Interferon-regulierter Gene wie ISG56/IFIT1 und IFI16, die zur antiviralen Immunantwort beitragen. Diese Aktivierung benötigte den IKK-Signalweg, der gleichzeitig die verstärkte Degradation von ZNF395 induzierte. Das Ziel dieser Arbeit lag darin, den Beitrag von ZNF395 bei der angeborenen Immunantwort und dessen Regulation, v.a. durch Hypoxie und den IKK-Komplex, zu charakterisieren. Wie Immunfluoreszenz-Analysen zeigten, konnte eine Expression von ZNF395 im Kern von Tumorzellen in einzelnen Tumoren und weit häufiger im Zytoplasma von Immunzellen des Tumorstromas nachgewiesen werden. Diese konnten als CD79a+ B-Lymphozyten sowie CD14+ Monozyten identifiziert werden, hingegen war ZNF395 in CD68+ Makrophagen nur schwach detektierbar. Eine Verringerung der Expression von ZNF395 konnte im Zuge der Reifung von Monozyten zu Makrophagen am Beispiel der Monozyten-Zelllinie U937 mit Western Blot und qRT-PCR-Analysen bestätigt werden. C/EBP, ein Transkriptionsfaktor, der eine essenzielle Rolle für die Differenzierung von Monozyten spielt, aktivierte den ZNF395 Promotor, wie Reportergenanalysen offenbarten. Dies unterstützt die Annahme, dass ZNF395 eine funktionale Rolle in Monozyten hat und seine Expression im Rahmen der Makrophagen-Reifung abnimmt. Die Induktion von ZNF395 unter Hypoxie benötigt den Hypoxie-induzierten Transkriptionsfaktor HIF1, dessen Aktivität auch in Monozyten von Bedeutung ist. Es konnte zudem gezeigt werden, dass der IKK-Komplex, der durch Zytokine u.a. im Verlauf der Makrophagen Reifung aktiviert wird, für die Funktion von ZNF395 als Transkriptionsfaktor essenziell ist. Reportergenanalysen und Knockdown-Experimente zeigten, dass sowohl aktives IKK als auch IKK notwendig sind, dass ZNF395 den ISG56 Promotor aktivieren kann aber gleichzeitig auch dessen proteasomalen Abbau fördern. Bei diesem verstärkten IKK-stimulierten „turn over“ könnte es sich um einen negativen Feedback-Mechanismus handeln der dazu beiträgt, dass die Aktivierung der Zielgene durch ZNF395 gering und nur vorübergehend ist. SiRNA und qRT-PCR Analysen offenbarten, dass ZNF395 für die maximale IFN-vermittelte Induktion der IFN-regulierten Gene ISG56/IFIT1, ISG54/IFIT2, IFI44 und IFI16 notwendig ist. ZNF395 konnte die IFN-abhängige Induktion der hier untersuchten antiviralen Faktoren bis zu zehnfach modulieren. Dies zeigt, dass ZNF395 zur Etablierung eines antiviralen Status der Zelle maßgeblich beiträgt. Die in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse belegen, dass im Rahmen der angeborenen Immunantwort und Entzündung die transkriptionelle Aktivität von ZNF395 über Stimulierung von HIF1 und IKK erhöht wird und somit die Effizienz der IFN-Antwort verstärken kann. HIF1 und IKK sind auch in Karzinomen regelmäßig konstitutiv aktiv, was zu erhöhten Mengen an aktivem ZNF395 führt, das dann über die Aktivierung seiner krebsassoziierten Zielgene die Karzinogenese unterstützen könnte.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Genome-wide expression analyses found the so far poorly characterized transcription factor ZNF395 upregulated in various cancers and particularly in response to hypoxia. Microarray analysis demonstrated that overexpression of ZNF395 upregulated a small subset of cancer-associated genes as well as interferon-regulated genes known to contribute to an antiviral immune response, such as ISG56/IFIT1 and IFI16. The activation of transcription by ZNF395 required IKK signaling which simultaneously induced the proteasomal degradation of ZNF395. The aim of this work was to characterize the involvement of ZNF395 in the innate immune response and to decipher its regulation by hypoxia and the IKK complex. As shown by immunofluorescence (IF) analyses, a nuclear expression of ZNF395 was occasionally detectable in tumor cells of various cancers. More frequently, a cytoplasmic expression of ZNF395 was observed in immune cells present in the tumor stroma. These cells could be identified as CD79a+ B-lymphocytes and CD14+ monocytes, while the expression in CD68+ macrophages was weak. A reduction of the expression of ZNF395 during monocyte differentiation could be confirmed in the monocytic cell line U937 by IF, Western blot and qRT-PCR analyses. Reporter gene analyses revealed that C/EBP, a transcription factor also known to play an essential role in monocyte differentiation, was able to activate the ZNF395 promoter. These observations support the assumption that ZNF395 plays a functional role in monocytes and that its expression is altered during macrophage maturation. The induction of ZNF395 upon hypoxia required the hypoxia-inducible transcription factor HIF1 which is also involved in monocyte function. Furthermore, it was demonstrated that activity of the IKK complex, which is also activated by cytokines during the macrophage maturation process, is essential for ZNF395 to activate transcription. Reporter gene assays and knockdown experiments demonstrated that both IKK and IKK are required for ZNF395-induced ISG56 promoter activation, but simultaneously enhance the proteasomal degradation of ZNF395. This IKK-induced turn over may represent a negative feedback mechanism to ensure that the activation of target genes by ZNF395 is weak and transient. SiRNA and qRT-PCR analyses revealed, that ZNF395 is required for the maximal IFN-induction of IFN-regulated genes ISG56/IFIT1, ISG54/IFIT2, IFI44 and IFI16. ZNF395 could modify the range of IFN-mediated induction of these antiviral factors up to ten-fold. This demonstrates that ZNF395 strongly contributes to the establishment of an antiviral state within the cell. These results show that during innate immune response and within inflammation, the transcriptional activity of ZNF395 increases due to hypoxia and IKK stimulation, thus leading to an enhanced IFN-response. Furthermore, HIF1 and IKK are frequently constitutively active in cancer, resulting in elevated amounts of active ZNF395 that may contribute to carcinogenesis by inducing its cancer-associated target genes. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Herwartz, Christine christine.herwartz@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-56071
Date:	May 2014
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Virologie > Institut für Virologie
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language ZNF395 UNSPECIFIED PBF UNSPECIFIED IKK ISG56 Hypoxia UNSPECIFIED
Date of oral exam:	31 January 2014
Referee:	Name Academic Title Plickert, Günter Prof. Dr. Pfister, Herbert Prof. Dr. Dr. h.c.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5607