Universität zu Köln

Ruppert, Manuela Barbara (2013). Dissecting Tbh and Hangover function in ethanol tolerance in Drosophila melanogaster. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Development of ethanol tolerance is one behavior that is strongly associated with alcohol addiction in humans. Drosophila melanogaster has been established as a model to study the mechanistic bases of ethanol tolerance. Previously it was determined that at least two different mechanisms contribute to tolerance (Scholz et al., 2005). One is acting at the level of a neuronal circuit to modulate brain function in response to ethanol and is mediated by octopamine (OA). OA is implicated in regulating organismal stress responses. The other one acting at cellular level is Hangover (Hang) dependent with Hang regulating cellular stress response likely to mediate neuroprotective mechanisms and to protect the CNS from ethanol-induced damage. In this thesis the two mechanisms were further investigated. The key enzyme in OA synthesis is the tyramine-b-hydroxylase (Tbh) encoded by the Tbh gene. To get a better understanding of the molecular nature of known Tbh mutants the molecular organization of Tbh was investigated by PCR studies and Northern Blot analysis. At least eight transcripts were identified. In addition, three different antibody sera against Tbh were analyzed. Two of the antisera (Zhou et al., 2008; Cibik, 2007) were confirmed to be Tbh specific. Using these antibody sera at least five Tbh isoforms were revealed. Tbh specificity of the third Tbh antiserum (Hampel, 2004) could not be confirmed completely but two additional putative Tbh isoforms were uncovered. Expression of four of the five identified Tbh isoforms was altered in TbhnM18 mutants. However expression was still detectable. This indicates the mutant is not a null allele for all Tbh isoforms. Expression studies in larval CNS in combination with expression studies using head and body fractions in Western Blot analysis suggest that the identified protein isoforms are expressed in different sets of neurons and in different tissues and localized differently in the cells. To generate a complete loss of function of the Tbh gene, the new TbhR3-XP-del mutant was generated by mutagenesis using FLP recombination. Tbh protein analysis revealed that the TbhR3-XP-del mutant is also not a null allele for all Tbh isoforms. However, phenotypic analysis of the mutants further suggests that the altered isoforms (58kDa or/and 74kDa) specifically have a function in ethanol tolerance development. Further, using a heat inducible Tbh transgene it was shown that Tbh function most likely is required in the adult fly for tolerance development. Hang is supposed to interact with RNA/DNA with dunce (dnc) being a potential target of Hang (Scholz and Klebes, unpublished data). dncD143 and hangAE10 mutants share the same impairment in ethanol tolerance and in heat-ethanol cross tolerance (Scholz et al., 2005; Franz, 2008). Here, it was detected that in the dncD143 mutant dnc transcripts dncRA and dncRL are reduced and hang expression is increased. It could be shown that specifically dncRA is mediating ethanol tolerance. In contrast, in the hangAE10 mutant the dnc transcripts dncRB and dncRG/RN are reduced. In the dnc1 mutant dncRB expression and ethanol tolerance is also reduced. Therefore a role for dncRB in ethanol tolerance is suggested. It is assumed that Hang is negatively regulated by DncPA and Hang regulates dncRB expression. The results further suggest that there are two separate cAMP signaling pathways in which DncPA and DncPB operate to mediate normal ethanol tolerance. In the DncPA dependent pathway Hang might be negatively regulated by DncPA. This pathway is mediated only in a small set of neurons, in the PAM cluster of the mushroom body and in the F1 neurons of the fanshaped body. Interestingly, the same set of F1 neurons has been implicated in Homer dependent ethanol tolerance suggesting a common function for the neurons and/or putative interaction of Homer/dnc/ Hang. In the second Dnc dependent pathway specifically DncPB might be required in a Hang dependent manner. Additional experiments show that Hang does not operate as a transcription factor for DncPB isoforms indicating that this regulation is not on DNA but probably on RNA level. The DncPA dependent pathway is disrupted in the dncD143 mutant whereas in hangAE10 mutants the other pathway is disrupted. In the dnc1 mutant most likely both Dnc dependent pathways regulating ethanol tolerance development are disrupted. This provides good tools to further investigate the two separate Dnc dependent pathways. Taken together, Tbh isoforms and their relationship to the cellular stressor ethanol need to be further characterized to identify the ones required for ethanol tolerance. Furthermore, Hang might be activated by DncPA and dncRB expression might be regulated by Hang in two separate pathways. This means that a third pathway regulating ethanol tolerance was found clarifying the high complexity and diversity underlying ethanol tolerance development.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Toleranzentwicklung gegenüber Alkohol ist eine der Kriterien der Alkoholabhängigkeit bei Menschen. Drosophila melanogaster ist als Modellorganismus etabliert um zugrunde liegende Mechanismen der Alkoholtoleranzentwicklung zu untersuchen. In einer früheren Studie konnte gezeigt werden, dass wenigstens zwei verschiedene Mechanismen Toleranz vermitteln (Scholz et al., 2005). Der eine Mechanismus moduliert die Gehirnfunktion in einem neuronalen Netzwerk in Antwort auf Ethanol und betrifft Oktopamin (OA). OA ist an der Regulierung von organismischem Stress beteiligt. Der andere Mechanismus wird vermittelt durch Hangover (Hang) und reguliert auf Zellebene die Antwort auf zellulären Stress. Hang schützt das zentrale Nervensystem wahrscheinlich vor von Alkohol versursachten Schäden. In dieser Arbeit wurden beiden Mechanismen weiter untersucht. Das Schlüsselenzym in der OA Synthese ist die Tyramine-b-Hydroxylase (Tbh) welche vom Tbh Gen kodiert wird. PCR-Studien und Northern Blots wurden durchgeführt um die Organisation des Tbh-Gens besser zu beschreiben. Dabei wurden mindestens acht Tbh Transkripte identifiziert. Zusätzlich wurden drei verschiedene Tbh Antikörperseren auf ihre Tbh Spezifität hin untersucht. Für zwei der Antiseren (Zhou et al., 2008; Cibik, 2007) konnte eine Tbh Spezifität bestätigt werden. Mithilfe dieser Antiseren wurden mindestens fünf verschieden Tbh Isoformen identifiziert. Tbh Spezifität für den dritten Antikörper (Hampel, 2004) konnte nicht vollständig bestätigt werden. Dieser Antikörper detektiert zwei zusätzliche mögliche Tbh Isoformen. Die Expression von vier der fünf bestätigten Isoformen war in der TbhnM18 Mutante verändert. Tbh war jedoch noch detektierbar, was impliziert, dass die Mutante im Bezug auf alle Tbh Isoformen kein Nullallel ist. Expressionsstudien im larvalen Nervensystem in Kombination mit Expressionsstudien in Kopf und Körper von adulten Fliegen lassen darauf schließen, dass die verschiedenen Tbh Isoformen in unterschiedlichen neuronalen Untereinheiten und in unterschiedlichem Gewebe exprimiert werden. Desweiteren sind die verschiedenen Isoformen wahrscheinlich unterschiedlich in der Zelle lokalisiert. Die neue TbhR3-XP-del Mutante wurde mithilfe von FLP-Rekombination hergestellt um einen vollständigen Tbh Funktionsverlust zu erzielen. Allerdings liegt in dieser Mutante Tbh weiter vor, was diese Mutante ebenfalls zu keiner Nullmutante für alle Tbh Isoformen macht. Die TbhR3-XP-del Mutante zeigt reduzierte Ethanoltoleranz, was in Kombination mit der Tbh Expressionsstudie darauf schließen lässt, dass wahrscheinlich nur zwei bestimmte Isoformen (58kDa, 74kDa) Alkoholtoleranz vermitteln. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Tbh Funktion zur Vermittlung von Alkoholtoleranz womöglich erst in adulten Fliegen benötigt wird. Es wird angenommen, dass Hang mit DNA/RNA interagiert, wobei dunce (dnc) ein mögliches Zielgen von Hang ist (Scholz und Klebes, unveröffentlichte Daten). dncD143 und hangAE10 Mutanten weisen beide den gleichen Defekt in Alkoholtoleranzentwicklung und Hitze-Ethanol-Crosstoleranz auf (Scholz et al., 2005; Franz, 2008). Es wurde hier gezeigt, dass in der dncD143 Mutante die dnc Transkripte dncRA und dncRL reduziert vorliegen und die hang Expression erhöht ist. Es konnte gezeigt werden, dass spezifisch dncRA die Ethanoltoleranz vermittelt. In der hangAE10 Mutante hingegen sind die dnc Transkripte dncRB und dncRG/RN reduziert. Im Vergleich mit der dnc1 Mutante, in der dncRB Expression und Ethanoltoleranz ebenfalls reduziert sind, zeigt sich, dass wahrscheinlich ebenfalls dncRB an der Entwicklung von Ethanoltoleranz beteiligt ist. Es wird vermutet, dass Hang negativ reguliert wird durch dncRA und Hang die Expression von dncRB reguliert. Desweitern lassen die Ergebnisse vermuten, dass es zwei separate cAMP Signalwege sind, in denen DncPA und DncPB agieren um Ethanoltoleranz zu vermitteln. Der Signalweg in dem DncPA agiert wird Hang möglicherweise negativ reguliert von DncPA. Es konnte gezeigt werden, dass dieser Signalweg in wenigen Neuronen vermittelt wird und zwar in den PAM Neuronen im Pilzkörper und in den F1 Neuronen im fächerförmigen Körper. Interessanterweise, wurde in einer früheren Studie gezeigt, dass die F1 Neurone ebenfalls Homer abhängige Ethanoltoleranz vermitteln. Dies lässt eine allgemeine Funktion dieser Neurone vermuten oder eine mögliche Interaktion von Homer/dnc/Hang. Im zweiten Dnc abhängigen Signalweg agiert wahrscheinlich DncPB in Abhängigkeit von Hang. Weitere Ergebnisse zeigten, dass hierbei die Interaktion von Hang und dncRB nicht auf DNA Level ist, weil Hang kein Transkriptionsfaktor von dncRB ist. Hang reguliert dncRB wahrscheinlich auf RNA Ebene. In der dncD143 Mutante ist nur der DncPA abhängige Signalweg gestört und in der hangAE10 Mutante nur der DncPB abhängige Signalweg. In der dnc1 Mutante hingegen sind vermutlich beide Signalwege unterbrochen. Die Mutanten bieten geeignete Tools um die beiden Signalwege weiter zu untersuchen. Abschließend kann gesagt werden, dass die Tbh Isoformen und ihr Verhältnis zum zellulären Stressor Ethanol näher untersucht werden müssen um die Isoformen zu identifizieren, die für die Entwicklung von Ethanoltoleranz wichtig sind. Desweitern, im Bezug auf Ethanoltoleranz scheint Hang durch DncPA aktiviert zu werden und dncRB Expression durch Hang reguliert zu werden und das wahrscheinlich in zwei separaten Signalwegen. Das bedeutet, dass ein dritter Signalweg, welcher Ethanoltoleranz vermittelt, gezeigt werden konnte. Dadurch wird die Komplexität und Diversität die der Entwicklung von Ethanoltoleranz zugrunde liegt deutlich. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Ruppert, Manuela Barbara manu_ruppert@yahoo.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-56158
Date:	15 October 2013
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Zoologisches Institut
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Drosophila English Alcohol induced behavior English Octopamine English Dunce English Phosphodiesterase English
Date of oral exam:	25 November 2013
Referee:	Name Academic Title Scholz, Henrike Prof. Dr. Roth, Siegfried Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5615