Universität zu Köln

Lichtenauer, Urs Daniel (2014). Adrenal progeny and factors of adrenal differentiation. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Radioactive and transgenic tracing experiments indicate that the adult adrenal cortex is maintained by a common pool of stem cells, which reside in the periphery of the adrenal cortex in the subcapsular zone. For repopulation, adrenal progenitor cells migrate towards the organ center, where they differentiate within the different specialized adrenocortical zones and take over specific adrenocortical functions. However, isolation and detailed investigation of adrenal progenitor cells has been hampered by the lack of known marker genes. There is convincing data that utilizing the side population, which is based on Hoechst 33342 dye exclusion, leads to an enrichment of progenitor or stem cells in the hematopoietic system and multiple other tissues. In the absence of known stem cell marker genes, we employed the side population technique on adrenal cells. In contrast to non-side population cells, side population cells readily grew over several passages in vitro. Furthermore, after 4 weeks in culture, immunohistochemistry revealed steroidogenic enzyme expression, suggesting spontaneous differentiation. Microarray analysis was performed and showed that the two populations clearly differed on the mRNA level. However, none of the genes analyzed presented with a substantially higher expression level to be considered a valuable adrenal stem cell marker candidate. Interestingly, the quantity of side population cells was significantly diminished in the context of Pbx1 haploinsufficiency. This transgenic mouse model is associated with smaller adrenal glands, a lower adrenal proliferation rate, and impaired adrenal function, suggesting a stem cell deficit in these animals. In contrast, Tpit-/- mice, which are ACTH-deficient, presented with a subcapsular zone width, which was significantly enlarged in comparison to wild type adrenals. Accordingly, the number of side population cells in these mice was significantly higher. ACTH treatment of these animals not only reverted the subcapsular zone width back to normal, but also resulted in a reduction of the side population fraction to a level similar to that of wild type animals, providing indirect evidence for a stem cell ‘arrest’ in the state of ACTH deficiency. Overall, adrenal side population cells seem to be enriched with progenitor cells with a rather differentiated or designated phenotype. To define the characteristics of multipotent versus somatic adrenal stem cells, a fusion model was established. Herein, PEG mediated cell fusion between murine adult adrenal and embryonic stem cells was performed, however, did not render the expected spectrum of progenitor cells. The involvement of stem cell like cancer cells in adrenal tumorigenesis was assessed by identifying the side population in different human adrenal tumor entities and in the human adrenocortical carcinoma cell line NCI H295R. The latter were analyzed further and characterized, however, a tumor stem cell-like behavior could not be detected: NCI H295R side population cells had no greater contribution to tumor growth compared to the other cells and had no survival benefit upon exposure to chemotherapeutic substances, typically administered in this tumor entity. Therefore, identifying side population cells does not per se guarantee stemness, and should always result in further extensive investigations.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Nebennierenwachstum and Differenzierungsfaktoren German
Translated abstract:	Abstract Language In Untersuchungen mit Hilfe radioaktiver- und transgener Tracer konnte gezeigt werden, dass die adulte Nebenniere einen subcapsulären Stammzellpool aufweist, der für die Organplastizität hauptsächlich verantwortlich zu sein scheint. Für Regenerations- und Anpassungsvorgänge migrieren Zellen aus dem subcapsulären Bereich ins Organinnere, wo sie innerhalb der verschiedenen spezialisierten adrenocorticalen Zonen differenzieren und endokrine Organfunktionen übernehmen. Die Isolierung und Charakterisierung der Nebennierenstammzelle ist allerdings bisher nicht gelungen, nicht zuletzt aufgrund fehlender bekannter Nebennierenstammzellmarker. Es kann angenommen werden, dass durch die Gewinnung der „Side Population“ (SP) aus Knochenmark und vielen anderen Geweben adulte Stammzellen angereichert werden können. Wegen fehlender Stammzellmarker passten wir die Methode an Nebennierenzellen an und konnten zeigen, dass SP-Zellen – im Gegensatz zu nicht-SP Zellen –über viele Passagen hinweg in vitro kultiviert werden konnten. In SP-Zellkulturen konnte darüber hinaus nach 4 Wochen die Expression typischer Steroidenzyme immunhistologisch nachgewiesen werden, was auf eine spontane Differenzierung hindeutet. Auf der Suche nach weiteren, nebennierenspezifischeren Stammzellmarkern führten wir eine genomweite Microarray Analyse an SP und Nicht-SP-Zellen durch. Obwohl sich die beiden Populationen in Bezug auf ihr Expressionsmuster unterschieden, ließen sich keine Gene ermitteln, die als potentielle Nebennierenstammzellmarker in Frage gekommen wären. Transgene Mäusen, die haploinsuffizient für den Transkriptionsfaktor Pbx1 sind, zeichnen sich u.a. durch kleinere Nebennieren mit einer geringeren Proliferationsrate und beeinträchtigter Nebennierenrindenfunktion aus. Interessanterweise fand sich in diesen Tieren ein deutlich reduzierter adrenaler SP-Zell Anteil, so dass hier möglicherweise ein Stammzelldefizit vorliegen könnte. Bei ACTH-defizienten Tpit-/- Mäusen hingegen war die subcapsuläre Zone im Vergleich zu Wildtyptieren deutlich verbreitert. Passenderweise war der Anteil der adrenalen SP-Zellen in diesem Fall deutlich erhöht. Eine ACTH-Langzeittherapie der Tiere normalisierte nicht nur die Breite der subcapsulären Zone, sondern reduzierte auch die SP-Zellfraktion auf ein mit Wildtyptieren vergleichbares Niveau, was indirekt auf einen „Stamzellarrest“ in Tpit-/- Tieren hinweisen könnte. Aufgrund dieser Daten gehen wir zusammenfassend davon aus, dass es sich bei Nebennieren SP-Zellen am ehesten um schon recht differenzierte direkte oder designierte Vorläuferzellen handelt. Um somatische Progenitorzellen und multipotente Stammzellen in der Nebenniere identifizieren, unterscheiden und charakterisieren zu können, wurde ein komplexes PEG-basiertes Fusionsmodell etabliert. Leider zeigten aber die resultierenden Zellen und Fusionshybride nicht das gewünschte Spektrum an unterschiedlich differenzierten Stammzellen. Des Weiteren wollten wir wissen, ob SP-Zellen als Tumorstammzellen in humanen Nebennierentumoren und der adrenocorticalen Zelllinie NCI H295R eine Rolle spielen könnten. Insbesondere die Zelllinie wurde detailliert untersucht, stammzellartige Eigenschaften konnten jedoch, trotz eindeutig identifizierbarer SP-Zellen, nicht gefunden werden: NCI H295R SP Zellen wuchsen nicht schneller und hatten, inkubiert mit diversen gebräuchlichen Chemotherapeutika, keinen Überlebensvorteil gegenüber Nicht-SP-Zellen. Es muss geschlussfolgert werden, dass der Nachweis von SP-Zellen das Vorhandensein von Stammzelleigenschaften nicht verlässlich vorhersagen kann und die isolierten Zellen stets einer genaueren funktionellen Untersuchung unterzogen werden müssen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Lichtenauer, Urs Daniel urs.lichtenauer@med.uni-muenchen.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-56390
Date:	26 May 2014
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Zentrum für Molekulare Medizin
Subjects:	Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language adrenal stem cell, adrenal progenitor, tumor stem cell English Nebennierenstammzelle, Tumorstammzelle, Nebennierenentwicklung German
Date of oral exam:	26 May 2014
Referee:	Name Academic Title Abken, Hinrich Prof. Dr. Brüning, Jens Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5639