Morphology of antennal hair ﬁeld afferents, descending interneurons and mesothoracic motoneurons, and in situ calcium imaging of retrogradely labeled retractor coxae neurons in the stick insect.

Goldammer, Jens (2013). Morphology of antennal hair ﬁeld afferents, descending interneurons and mesothoracic motoneurons, and in situ calcium imaging of retrogradely labeled retractor coxae neurons in the stick insect. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

The phasmid species Carausius morosus serves as an established animal for studying terrestrial locomotion and antennal movements for tactile exploration of the near-range environment, but neuroanatomical data is only limited available. In the ﬁrst part of this thesis, ﬂuorescent dye stainings of antennal hair ﬁeld sensilla, which are important antennal joint angle sensors, and stainings of all antennal motor nerves were performed to receive detailed insights into the neuroanatomical organization of the stick insects’ antennal sensorimotor system. It was shown that afferents of all seven antennal hair ﬁelds (HF) send collaterals into the dorsal lobe, a deutocerebral neuropil region in the brain, and further descend through the circumoesophageal connective to the suboesophageal ganglion (SOG), where these afferents terminate. Moreover, double stainings of HFs located on different antennal segments and of HFs with different direction properties showed similar staining patterns, but differences were found in a spatially different formation of synaptic boutons within the entire depth of the dorsal lobe and within the SOG. In the dorsal lobe, HF afferents and projections of antennal motoneurons overlap, which could be an indication for direct synaptic contacts. Interestingly, stainings of the antennal nerve of the ﬂagellum revealed another deutocerebral neuropil separated from the dorsal lobe, the ventral area of ﬂagellum afferents described for crickets. Besides, thoracic connectives were stained to reveal somata of descending interneurons (DIN) located in the brain and SOG. Axonal backﬁlls of cervical (neck) connectives revealed up to 410 cell bodies of DINs (brain: 205, SOG: 205), and backﬁlls of connectives between the pro- and mesothoracic ganglia stained up to 173 DINs (brain: 83, SOG: 90). Furthermore, in double stainings of connectives and scapal HF sensilla it was observed that neurites of DINs seem to be in vicinity to afferents of HFs, which suggests that antennal HF signals are transmitted via a fast cephalothoracic pathway to thoracic motor centers. In the second part, the morphology of leg motoneurons, dorsal unpaired median neurons (DUM), and sensory neurons in the stick insect mesothoracic ganglion were examined. For this, cut ends of lateral nerves were retrogradely labeled with ﬂuorescent dyes. Numbers of motoneurons and details of their structure by far exceed previously published data. Somata of excitatory motoneurons form clusters in the lateral ganglion cortex and their dendrites branch mainly in the dorsal neuropil. Nine DUM neurons were identiﬁed, six of which have axons in nervus lateralis 5, which innervates the retractor coxae muscles. Most sensory ﬁbers terminate in the ventral association center (VAC). Twenty-three small cell bodies located close to the soma of the fast extensor tibiae motoneuron (FETi) likely belong to strand receptors. Stained structures are compared with previously published data from stick insects and other orthopteran insects. In the third part, a calcium (Ca2+) imaging method is introduced for retrograde loading cut ends of stick insect retractor coxae motoneuron axons with a Ca2+-sensitive ﬂuorescent indicator. Intracellular Ca2+ changes were induced either by the application of the muscarinic acetylcholine agonist pilocarpine into the thoracic cavity and by tactile stimulation of the animal’s abdomen. The measured intracellular Ca2+ dynamics are very similar and temporarily uniform across primary and secondary motoneuron neurites. Calculated integrals of measured intracellular Ca2+ changes and integrals of retractor coxae spike activity revealed a linear correlation. This suggests that the observed changes in intracellular Ca2+ result from activation of voltage-gated Ca2+ channels by membrane depolarizations. Moreover, Ca2+ changes of lateral DUM neurites could be measured. A ﬁrst analysis of pilocarpine-induced Ca2+ transients in presumed three different DUM neurites revealed regular and in-phase Ca2+ oscillations. These DUM neurite Ca2+ elevations have no ﬁxed phase relation to either the protractor coxae nor the retractor coxae spike activity.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Abstract

Language

Die Stabheuschrecke Carausius morosus ist ein etabliertes Tier für die Untersuchung von Laufbewegungen und Antennenbewegungen zur taktilen Erkundung der Umwelt. Neuroanatomische Studien sind hierzu aber nur limitiert vorhanden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die neuroanatomische Strukturierung des sensomotorischen Systems der Antenne von Stabheuschrecken untersucht. Dazu wurden Färbungen mittels Fluoreszenzfarbstoffen von Sinneshaaren antennaler Borstenfelder, welche als wichtige Gelenkwinkelsensoren fungieren, sowie Färbungen aller antennalen motorischen Nerven durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass Afferenzen aller sieben Borstenfelder im Dorsallobus, einem deutocerebralen Neuropil im Gehirn, verzweigen und durch das Schlundkonnektiv zum Suboesophagealganglion (SOG) absteigen und dort terminieren. Des Weiteren wurden Doppelfärbungen von Borstenfeldern auf unterschiedlichen Segmenten der Antenne und von Borstenfelder mit unterschiedlichen Richtungseigenschaften angefertigt. Diese Färbungen zeigten ähnliche Projektionsmuster der unterschiedlichen Borstenfelder. Abweichungen wurden jedoch in einer unterschiedlichen Anordnung von synaptischen Boutons im Gehirn und SOG beobachtet. Innerhalb des Dorsallobus überlappen Projektionsmuster von Borstenfeld-Afferenzen mit Verzweigungen von antennalen Motoneuronen. Dies könnte bedeuten, dass direkte synaptische Kontakte möglich sind. Interessanterweise wurde in Präparaten mit Färbungen des Antennalnervens des Flagellums eine weitere Neuropilregion im Gehirn entdeckt. Diese Region ist abgegrenzt vom Dorsallobus und wurde bei Grillen als das ventrale Areal von Flagellum-Afferenzen (VFA) bezeichnet. Zusätzlich wurden Axone thorakaler Konnektive gefärbt, um absteigende Interneurone im Gehirn und SOG zu färben. Retrograde Färbungen von Halskonnektiven zeigten bis zu 410 Zellkörper (Gehirn: 205, SOG: 205), während bei Färbungen der Konnektive zwischen Pro- und Mesothorakalganglion 173 Zellkörper von absteigenden Interneuronen identiﬁziert wurden (Gehirn: 83, SOG: 90). Präparate mit Doppelfärbungen von Konnektiven und Borstenfeld-Afferenzen ergaben, dass Neuriten von absteigenden Interneuronen in der Nähe von Borstenfeld-Afferenzen zu ﬁnden sind. Dies lässt vermuten, dass Signale von Borstenfeldern direkt über absteigende Interneurone zu thorakalen Netzwerken weitergeleitet werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Morphologie von Motoneuronen, dorsalen ungepaarten medianen Neuronen (DUM) und sensorischen Neuronen untersucht. Dies erfolgte über durchgeschnittene laterale Nerven des Mesothorakalganglions mittels retrograder Applikation von Fluoreszenzfarbstoffen. Es konnte gezeigt werden, dass die Anzahl von Motoneuronen und DUM-Zellkörper erheblich höher liegt als bisher publiziert wurde. Die Zellkörper von exzitatorischen Motoneuronen bilden Gruppen in ganglionären Randbereichen und ihre Dendriten sind hauptsächlich in dorsalen und lateralen Bereichen des Ganglions zu ﬁnden. Insgesamt wurden neun DUM-Zellkörper gefärbt. Sechs dieser Neurone besitzen Axone im Nervus lateralis 5 (nl5), welcher die Retraktor coxae Muskeln innerviert. Die meisten gefärbten sensorischen Afferenzen terminieren in dem sogenannten ventralen Assoziationszentrum (VAC) des Ganglions. In der Nähe des Zellkörpers des “schnellen Extensor tibiae Motoneurons” (FETi) wurden 23 kleine Zellkörper entdeckt. Bei diesen Neuronen handelt es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um sogenannte Sehnenrezeptoren. Die erzielten Ergebnisse wurden außerdem mit vorhandenen Publikationen von Stabheuschrecken und anderen orthopteroiden Insekten verglichen. Im dritten Teil wird eine “Calcium (Ca2+)-Imaging” Methode vorgestellt für das retrograde Beladen von durchtrennten Motoneuron-Axonen des nl5 mit einem Ca2+-sensitiven ﬂuoreszierenden Indikator. Intrazelluläre Ca2+-Änderungen wurden induziert durch Applikation des muskarinischen Acetylcholinrezeptoragonisten Pilocarpine in die thorakale Öffnung des Tieres und durch taktile Stimulation des Tieres. Die gemessenen intrazellulären Ca2+-Änderungen in Primär- und Sekundärneuriten von Retraktor coxae Motoneuronen sind sehr ähnlich und zeitlich gleichförmig. Berechnete Integrale von intrazellulären Ca2+-Änderungen und Integrale der Retraktor coxae Motoneuronaktivität zeigten eine lineare Korrelation. Dies bedeutet, dass die gemessene Änderung des intrazellulären Ca2+ in Retraktor coxae Motoneuronen von der Aktivierung von spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen als Folge von Membrandepolarisierungen abhängig ist. Darüber hinaus war es möglich, Ca2+-Transienten in lateralen DUM-Neuriten zu messen. Eine erste Analyse von Ca2+-Änderungen in drei vermeindlichen DUM-Neuriten, ausgelöst durch Applikation von Pilocarpine, zeigte reguläre und gleichphasige intrazelluläre Ca2+-Änderungen. Die Ca2+-Erhöhungen in DUM-Neuriten zeigten weder mit der Aktivität von Protraktor coxae Motoneuronen noch mit der Aktivität von Retraktor coxae Motoneuronen einen festen Phasenbezug.

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