Universität zu Köln

Sadler, Thomas (2014). Interaction of Daphnia magna with cyanobacteria: New insights from using high-resolution LC-MS. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

In most freshwater ecosystems the unselectively filter feeding cladoceran Daphnia is of major importance for the transfer of energy, carbon and nutrients across the plant - herbivore interface. Especially in freshwaters with a high abundance of cyanobacteria this transfer is often constrained by food quality rather than food quantity, since cyanobacteria are considered as low quality food for daphnids. Cyanobacteria lack several nutritional components that are important for daphnids, they can interfere mechanically with the filter apparatus of daphnids due to colony formation and they contain numerous cyanotoxins. The importance of the Daphnia - cyanobacteria interaction is additionally emphasized by an increasing anthropogenic influence on ecosystems, which includes artificial nutrient input into lakes and ponds as well as increasing temperatures due to global warming. These human impacts contribute to the extent and frequency of cyanobacterial blooms, which in return constitute a serious hazard for public health and ecosystem services. Studies concerned with this crucial interaction reveal contradictory results, in which sometimes cyanobacteria suppress Daphnia populations whereas in other cases the opposite situation can be observed, namely the suppression of cyanobacteria by daphnids. Daphnia species display an enormous ability to adapt to cyanobacteria. As a result, huge differences among Daphnia species and genotypes with regard to their sensitivity towards cyanobacterial diets can be found. Despite the importance of the Daphnia - cyanobacteria interaction for the structure of freshwater ecosystems, the knowledge about the physiological basis of this interaction is scarce. In order to elucidate important aspects of the physiology that underlies the Daphnia - cyanobacteria interaction the present study focused mainly on toxic cyanobacterial secondary metabolites. To detect and quantify cyanobacterial compounds in exposure experiments with daphnids and toxin containing cyanobacteria, high resolution LC-MS technology was applied. This approach, in combination with other techniques, such as enzyme activity measurements and molecular biological methods, revealed several new insights into the physiology of the interaction of Daphnia with cyanobacteria. It is argued that one major reason explaining the huge differences among daphnids with regard to their sensitivity towards cyanobacteria might lie in their ability to cope with cyanotoxins such as microcystin-LR (MCLR). The widely accepted hypothesis regarding dietary MCLR in Daphnia includes the involvement of glutathione-S-transferase acting as a first step of detoxification by conjugating the toxin with glutathione (GSH). I was able to reject this hypothesis by measuring MCLR amounts in all parts of an exposure experiment (incubation medium, cyanobacteria and Daphnia tissue) with Daphnia magna and the MCLR containing cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Since the presence of daphnids neither led to a decrease of overall MCLR nor to an increase of the MCLR-GSH conjugate significant processes of biotransformation of any kind could be ruled out. Instead the data revealed that MCLR is exported out of Daphnia tissue with a high efficiency. These transport processes had not been considered with regard to dietary MCLR in Daphnia yet. Furthermore, the study reveals that these transport mechanisms should not be considered as a special case for MCLR alone but that transport is of general importance with regard to dietary cyanotoxins in Daphnia, since a whole set of other structurally diverse cyanobacterial components were similarly exported out of Daphnia and not subjected to any forms of biotransformation. Additionally, I could identify two types of trans membrane transporters, namely multi xenobiotic resistance (MXR) proteins and organic anion transporting polypeptides (Oatps) being responsible for the export of MCLR out of Daphnia tissue. The application of specific inhibitors of these transporters resulted in significantly increased MCLR amounts within the Daphnia tissue. Although a qPCR analysis demonstrated that a 24 h exposure of daphnids to a MCLR containing diet is not enough to cause significant up-regulation of respective transporter genes, the results in this dissertation strongly emphasize the importance of transport mechanisms for the understanding of the Daphnia - cyanobacteria interaction. In the last part of my thesis I successfully developed a new method in order to unravel seasonal succession patterns of cyanobacterial chemotypes within a pond. Metabolomic fingerprints of a time series of phytoplankton samples were combined with the potential of these samples to inhibit grazer proteases by using multivariate statistics. This new approach revealed rapid changes within the cyanobacterial chemotype composition in a lake, which in return strongly reflect on Daphnia populations and emphasize the need for fast adaptation processes on the Daphnia side. In summary, the results of this dissertation reveal several new insights in the physiology of the Daphnia - cyanobacteria interaction, which elucidate the importance, necessity and nature of transport processes for detrimental cyanotoxins in Daphnia.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language In den meisten stehenden Süßwasser Ökosystemen sind unselektive Filtrierer der Gattung Daphnia von größter Wichtigkeit für den Transfer von Energie, Kohlenstoff und Nährstoffen von der Ebene der Primärproduzenten auf höhere trophische Ebenen. Insbesondere in Gewässern in denen Cyanobakterien in großer Menge vorkommen ist dieser Transfer in der Regel nicht mehr durch Futterquantität, sondern durch Futterqualität bestimmt. Cyanobakterien stellen für Daphnien eine Nahrungsquelle von sehr schlechter Qualität dar. Zum einen fehlen Ihnen wichtige Nährstoffe, die für Daphnien essentiell sind, zum anderen kommt es bei Cyanobakterien häufig zur Koloniebildung. Diese häufig fädigen Kolonien können den Filtrierapparat der Daphnien empfindlich stören oder sogar verstopfen. Zu guter Letzt enthalten Cyanobakterien häufig eine große Zahl verschiedener Toxine welche sich auch negativ auf Daphnien auswirken können. Entsprechend ist die Interaktion von Daphnien und Cyanobakterien von großer Wichtigkeit für limnische Ökosysteme. Dieser Befund wird noch weiter verstärkt durch den zunehmenden anthropogenen Einfluss auf solche Ökosysteme, welcher vor allem den künstlichen Eintrag von Nährstoffen, aber auch generell erhöhte Temperaturen aufgrund von globaler Erwärmung beinhaltet. Diese Einflüsse wirken sich positiv auf die Häufigkeit und auch das Ausmaß cyanobakterieller Massenaufkommen, sogenannter Blüten, aus. Solche cyanobakteriellen Blüten wiederum stellen eine große Gefahr für die öffentliche Gesundheit aber auch für die Nutzbarkeit von Ökosystemen dar. Studien die sich mit dem Zusammenspiel von Daphnien und Cyanobakterien auseinandersetzen haben sehr widersprüchliche Resultate geliefert. Manchmal wird von Cyanobakterien berichtet, welche einen starken Rückgang von Daphnien Populationen bewirken. Andere Studien zeigen das Gegenteil, nämlich den Rückgang von Cyanobakterien durch die Anwesenheit von Daphnien. Im Hinblick auf Cyanobakterien verfügen Daphnien über ein enormes Adaptationspotential. Dementsprechend findet man sehr große Unterschiede bzgl. der Sensitivität von verschiedenen Arten oder auch Genotypen derselben Art gegenüber Cyanobakterien. Trotz der Wichtigkeit der Interaktion von Daphnien mit Cyanobakterien für die Struktur von limnischen Ökosystemen weiß man nur wenig über die zugrundeliegende Physiologie. Der Hauptfokus der vorliegenden Dissertation bestand darin wesentliche physiologische Aspekte dieser Interaktion zu beleuchten. Dabei habe ich mich besonders auf toxische cyanobakterielle Sekundärmetabolite konzentriert. Insbesondere stand die Frage im Vordergrund, wie Daphnien mit diesen toxischen Komponenten umgehen. Um diese Komponenten, z.B. in Fraßexperimenten mit Daphnien und toxischen Cyanobakterien, zu detektieren und zu quantifizieren wurde hochauflösende Massenspektrometrie verwendet. Diese Methodik in Kombination mit weiteren Techniken, wie beispielsweise Enzymaktivitätsmessungen oder molekularbiologischen Methoden ergab eine Reihe neuer Erkenntnisse in die Physiologie der Interaktion von Daphnien mit Cyanobakterien. Ein Hauptgrund für die unterschiedlichen Sensitivitäten der Daphnien könnte darin bestehen, dass verschiedene Klonlinien unterschiedlich stark ausgeprägte Fähigkeiten besitzen mit solchen cyanobakteriellen Komponenten umzugehen. Bezüglich eines der häufigsten und am besten untersuchten Cyanotoxine, Microcystin-LR, geht eine weithin akzeptierte Theorie davon aus, dass das Enzym Glutathion-S-transferase von entscheidender Bedeutung für die Detoxifizierung ist, indem es Microcystin in einem erstem Schritt an das Tripeptid Glutathion konjugiert. Diese Theorie konnte von mir klar widerlegt werden. In einem Fütterungsexperiment mit Daphnia magna und dem Microcystin enthaltenden Cyanobakterium Microcystis aeruginosa wurden alle experimentellen Komponenten (Umgebungsmedium, Cyanobakterien und Daphniengewebe) bezüglich ihres Microcystingehalts untersucht. Da sich der Gesamtgehalt an Microcystin innerhalb des Experiments nicht verringert, unabhängig davon ob Daphnien präsent sind oder nicht, kann ausgeschlossen werden, dass es zu signifikanten Biotransformationprozessen von Microcystin gekommen ist. Es wurde passend dazu auch kein Anstieg des entsprechenden Konjugates von Microcystin und Glutathion gemessen. Stattdessen zeigten die Daten, dass Daphnien in der Lage sind, nichtkonjugierte Microcystine mit hoher Effizienz aus ihrem Gewebe zu transportieren. Solche Transportprozesse wurden für Daphnien in Bezug auf Cyanotoxine, die über die Nahrung aufgenommen werden, bisher nicht in Betracht gezogen. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass es sich bei diesem Befund nicht um einen Spezialfall für Microcystin handelt, sondern dass auch andere strukturell sehr unterschiedliche cyanobakterielle Metabolite in vergleichbarer Weise aus Daphniengewebe exportiert werden. Genau wie bei Microcystin kam es auch bei anderen Metaboliten nicht zu Biotransformationsprozessen irgendeiner Art. Zusätzlich konnte ich zwei Klassen von Transportern identifizieren die für den Export von Microcystin aus dem Daphniengewebe verantwortlich sind. Dabei handelt sich um „multi xenobiotic resistance“ (MXR) Proteine sowie „organic anion transporting polypeptides“ (Oatps). Die Anwendung spezifischer Inhibitoren für beide Transportertypen resultierte in erhöhten Microcystin Messwerten innerhalb der Daphniengewebe. Obwohl eine qPCR Analyse erbrachte, dass eine 24 stündiger Fraßperiode von microcystinhaltigen Cyanobakterien nicht ausreichen ist, um eine Hochregulierung entsprechender Transportergene in Daphnien zu bewirken, zeigen die Ergebnisse dennoch eindeutig, dass Transportprozesse von entscheidender Bedeutung für die Interaktion von Daphnien mit Cyanobakterien sind. Im letzten Teil meiner Dissertation habe ich unter Benutzung von hochauflösender Massenspektrometrie eine neue Methode entwickelt, um saisonale Sukzessionsmuster cyanobakterieller Chemotypen aufzudecken. Chemotypen bezeichnen die Summe der Sekundärmetabolite die von einem cyanobakteriellen Genotypen produziert werden. Hierfür wurden zunächst metabolomische Fingerabdrücke einer zeitlichen Serie von Phytoplanktonproben erstellt. Diese wurden anschließend unter Benutzung von multivariater Statistik mit dem Potential dieser Proben, Proteasen von Daphnien zu inhibieren, kombiniert. Dabei stellte sich heraus, dass die Chemotypen Zusammensetzung innerhalb des Phytoplanktons sehr starken und schnellen Schwankungen unterworfen ist. Dieser Befund wiederum wirkt sich massiv auf Daphnien Populationen aus und unterstreicht die Wichtigkeit von schnellen Anpassungsmechanismen. Zusammengefasst erbrachten die Ergebnisse dieser Dissertation mehrere neue Einsichten in die Physiologie der Interaktion von Daphnien und Cyanobakterien, welche die Wichtigkeit, die Notwendigkeit und die Eigenschaften von Transportprozessen für über die Nahrung aufgenommene Cyanotoxine in Daphnien aufzeigen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Sadler, Thomas thomas-sadler@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-58063
Date:	2014
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Zoologisches Institut
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language cyanobacteria, Daphnia, Microcystis, microcystin, transport, detoxification English Cyanobakterien, Daphnia, Microcystis, microcystin, Transport, Detoxifizierung German
Date of oral exam:	14 October 2014
Referee:	Name Academic Title Elert, Eric von Prof. Dr. Arndt, Hartmut Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5806