Universität zu Köln

Zamani-Nour, Shirin (2014). Characterization of cytosolic phosphoglucoisomerase (cPGI) through analysis of Arabidopsis thaliana mutants. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Phosphoglucoisomerase (PGI) is a key enzyme in carbohydrate metabolism. Two copies of this enzyme are encoded in the genome of Arabidopsis thaliana, one of which is located in plastids and the other one in the cytosol. Since loss-of-function of the plastidic isoform (PGI1) has already been analyzed and mutants have been shown to be starch-free, we were interested in the characterization of the cytosolic isoform (cPGI), which is involved in sucrose production. Absence of homozygous T-DNA mutants from the progeny of heterozygous parent plants and decreased transmission efficiency of the mutant allele through male and female gametes indicated impairment of both gametophyte and embryo vitality and development. Since homozygous T-DNA mutants were not available, we employed an artificial micro RNA (amiRNA)-based approach. For this purpose, two independent amiRNAs (1 and 2) against the cPGI mRNA were designed and two lines (6 and 10) from amiR1-cpgi and three lines (8, 9 and 10) from amiR2-cpgi were chosen for further analyses. Although cPGI activity was completely lost, these plants were viable but reduced in growth, leaf area and fresh weight compared to the wild-type. Furthermore, amiR-cpgi plants showed starch excess in chloroplasts and decreased sucrose content in leaves at the end of the night and an increased glucose content of cytosolic heteroglycans. In addition, simultaneous loss of cPGI activity and the ability to generate transitory starch led to severely impaired plant growth that could only be complemented by provision of external sucrose. These data suggest that amiR-cpgi plants may compensate loss of cPGI activity by partial starch degradation during the day which would provide an alternative source of glucose-6-phosphate necessary for sucrose production during the day. Moreover, photosynthesis in amiR-cpgi plants was impaired with plants displaying increased non-photochemical quenching (NPQ) in mutant plants making them easily distinguishable from the wild-type (Col-0). Taken together, results show that loss of cPGI function in mature leaves of amiR-cpgi mutants can be tolerated by the plant but strongly affects nocturnal starch breakdown and impacts the photosynthetic apparatus. However, during gametophyte and embryo development loss of cPGI function can apparently not be compensated metabolically, since viable homozygous T-DNA mutants could not be identified.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Phosphoglucoisomerase (PGI) ist ein Schlüsselenzym des Kohlenhydratstoffwechsels. Im Genom der Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana sind zwei Isoformen dieses Enzyms kodiert, wobei eine im Plastiden und die andere im Zytosol lokalisiert ist. Der Verlust der plastidären Isoform PGI1 führt zu einem vollständigen Ausfall des Stärkeaufbaus in der Pflanze, wie vorangegangene Untersuchungen an der PGI1-defizienten Mutante zeigen konnten. Die aktuelle Arbeit jedoch legt ihren Fokus auf die Charakterisierung der cytosolischen Isoform (cPGI), welche in der Saccharose-Biosynthese involviert ist. In der Nachkommenschaft heterozygoter cpgi T-DNA Insertionsmutanten konnten keine homozygoten Individuen nachgewiesen werden. In Verbindung mit einer reduzierten Transmissionseffizienz des Mutantenallels durch männliche und weibliche Gameten weist dies auf eine beeinträchtigte Gametophyten- und Embryonenvitalität und -entwicklung hin. In Ermangelung homozygoter T-DNA-Linien wurde ein microRNA (amiRNA)-basierter Ansatz verfolgt. Hierzu wurden zwei unabhängige amiRNAs gegen die cPGI mRNA (amiR1-cpgi und amiR2-cpgi) hergestellt und für die anschließenden Analysen zwei Linien der amiR1-cpgi (6 und 10) und drei Linien der amiR2-cpgi (8, 9 und 10) ausgewählt. Trotz des vollständigen Verlustes der cPGI-Aktivität waren die Pflanzen lebensfähig, jedoch wiesen sie im Vergleich zum Wildtyp ein reduziertes Wachstum, sowie verringerte Blattflächen und Frischgewichte auf. Weiterhin zeichneten sich amiR-cpgi Pflanzen durch eine Stärke Überakkumulation in Chloroplasten und einen reduzierten Saccharose-Gehalt in Blättern am Ende der Nacht aus, sowie durch einen erhöhten Glukosegehalt der cytosolischen Heteroglukane. Darüber hinaus führt der gleichzeitige Verlust von cPGI-Aktivität und der Fähigkeit transitorische Stärke zu bilden zu einer massiven Reduktion des Pflanzenwachstums, was nur durch die Gabe externer Saccharose kompensiert werden konnte. Diese Daten legen den Schluss nahe, dass amiR-cpgi Pflanzen den Verlust an cPGI Aktivität durch partiellen Stärkeabbau während des Tages kompensieren können und sich dadurch eine alternative Quelle für Fruktose-6-Phosphat zur Saccharosesynthese erschließen. Außerdem ist auch die Fotosynthese in amiR-cpgi Pflanzen beeinträchtigt. amiR-cpgi Pflanzen zeigen ein erhöhtes nicht-photochemisches Quenching (NPQ), was es möglich macht, amiR-cpgi Pflanzen leicht von Wildtyppflanzen (Col-0) zu unterscheiden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Verlust der cPGI Funktion in ausgewachsenen Blättern von amiR-cpgi Mutanten durch die Pflanze zwar toleriert werden kann, jedoch einen starken Effekt auf den nächtlichen Stärkeabbau hat und eine Beeinträchtigungen des Fotosynthese-Apparates bedingt. Während der Gametophyten- und Embryoentwicklung jedoch scheint dieser Verlust nicht metabolisch kompensierbar zu sein, da lebensfähige, homozygote T-DNA-Mutanten nicht identifiziert werden konnten. UNSPECIFIED
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Zamani-Nour, Shirin zamani@mpipz.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-58499
Date:	19 May 2014
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Botanical Institute
Subjects:	Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Arabidopsis thaliana,Carbohydrate metabolism, phosphoglucoisomerase (cPGI),Photosynthesis, Plant reproduction English
Date of oral exam:	24 June 2014
Referee:	Name Academic Title Flügge, Ulf-Ingo Prof. Dr. Kopriva, Stanislav Prof. Dr. Schnetz, Karin Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5849