Universität zu Köln

Bartsch, Anna Margarida (2015). Identification and functional characterization of cation/proton antiport systems in Corynebacterium glutamicum. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Corynebacterium glutamicum is a Gram-positive soil bacterium of the actinomycetes suborder Corynebacterineae and was first described in 1958 as a glutamic acid secreting bacterium. C. glutamicum is one of the major industrial production organisms for amino acids and related compounds. In addition, C. glutamicum serves as a model organism for closely related, dangerous human pathogens like Mycobacterium tuberculosis and Corynebacterium diphtheriae. This work aimes to get a better insight into Na+- and K+-homeostasis in C. glutamicum whereas the main focus was placed on the export of the cations. Good candidates for this function are cation/proton antiporters which exchange internal Na+ and/or K+ with external protons. Four putative cation/proton antiporter candidates were found in the genome of C. glutamicum: Mrp1, Mrp2, ChaA and NhaP. Their function as Na+/H+- and/or K+/H+- antiporters was proven on a physiological and on a biochemical level. The growth phenotype of C.glutamicum antiporter deficient mutants in presence of high NaCl or KCl concentrations revealed that Mrp1 and Mrp2 are the cation/proton antiporters with highest relevance during salt stress. The sole absence of Mrp1 lead to a Na+ sensitive phenotype whereas the lack of Mrp2 caused K+ sensitivity. ChaA and NhaP were of minor physiological importance. Antiporter deficient mutants also showed increased internal sodium concentrations ([Na+]i). Interestingly, the increase of [Na+]i caused the reduction of the internal potassium concentration ([K+]i). It could be shown that this fact is not caused by an altered membrane potential so that the cells probably actively downregulate [K+]i. Complementation studies with a C. glutamicum antiporter quadruple mutant (AQM) revealed that Mrp1 and ChaA are involved in Na+ ion export over a wide pH range of pH 6.5 to pH 9.0. The expression of mrp2 and nhaP at pH 9.0 also improved growth of the mutant. In addition, Mrp1, ChaA and NhaP were able to reduce the internal Na+ concentration in the C. glutamicum AQM background. The acridine orange fluorescence assay was used for the biochemical characterization of the putative antiporters. The corresponding C. glutamicum genes were expressed in the antiporterdeficient Escherichia coli strain KNabc and everted membrane vesicles were used to determine cation/proton antiport activities. All four antiporters were able to mediate Na+/H+- and K+/H+- antiport whereas Mrp1 showed a preference for sodium and NhaP seemed to prefer potassium.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Corynebacterium glutamicum ist ein Gram-positives Bodenbakterium aus der Actinobakterienunterordnung Corynebacterineae und wurde zum ersten Mal 1958 als ein Glutamat sezernierendes Bakterium beschrieben. In der Biotechnologie wird C. glutamicum zur Produktion von Aminosäuren und verwandten Produkten verwendet. Außerdem dient C. glutamicum als wichtiger Modellorganismus für seine human-pathogenen Verwandten wie zum Beispiel M. tuberculosis und C. diphtheriae. Das Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der Na+- und K+-Homöostase in C. glutamicum, wobei das Hauptaugenmerk auf dem Export dieser Kationen lag. Hervoragende Kandidaten für diese Funktion sind Kationen/Protonen-Antiporter, die intrazelluläre Na+- und/oder K+- Ionen gegen externe Protonen tauschen. Im Genom von C. glutamicum wurden vier putative Kationen/Protonen-Antiporter gefunden: Mrp1, Mrp2, ChaA and NhaP. Ihre Funktion als Na+/H+- und/oder K+/H+-Antiporter wurde physiologisch und biochemisch untersucht. Wachstumsexperimente mit Antiportermutanten in Gegenwart von hohen NaCl oder KCl Konzentrationen zeigten, dass Mrp1 und Mrp2 die wichtigsten Kationen/Protonen-Antiporter unter Salzstress sind. Die alleinige Abwesenheit von Mrp1 bzw. Mrp2 führte bereits zu Na+- bzw. K+-Sensitivität. ChaA und NhaP spielten eine untergeordnete Rolle. Außerdem zeigten die Antiportermutanten eine erhöhte interne Na+-Konzentration. Ein Anstieg dieser führte zu einer Abnahme des internen Kaliumgehaltes. Dies konnte nicht auf ein verändertes Membranpotential zurückgeführt werden, sodass die Zellen die interne Kaliumkonzentration aktiv runter regulieren. Komplementationsstudien mit einer C. glutamicum Mutante, der alle Antiporter fehlen, konnten zeigen, dass Mrp1 und ChaA am Export von Na+-Ionen in einem pH-Bereich von 6.5-9.0 beteiligt sind. Bei pH 9.0 konnte auch die Expression von mrp2 und nhaP das Wachstum der Mutante verbessern. Außerdem konnten Mrp1, ChaA und NhaP die interne Na+-Konzentration der Mutante verringern. Die biochemische Charakterisierung der Antiporter erfolgte in invertierten Membranvesikeln aus E. coli KNabc. Die entsprechenden Gene aus C. glutamicum wurden in diesem Stamm exprimiert und anschließend die Aktivität der Kationen/Protonen-Antiporter mit Hilfe eines Acridinorangefluoreszenz-basierten Tests bestimmt. Alle vier Antiporter waren in der Lage Na+/H+- und K+/H+-Austausch zu vermitteln, wobei Mrp1 eine Präferenz für Na+-Ionen und NhaP für K+-Ionen zeigte. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Bartsch, Anna Margarida anna.bartsch@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-59290
Date:	2015
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Natural sciences and mathematics Chemistry and allied sciences Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Corynebacterium glutamicum, cation homeostasis, potassium, sodium English Corynebacterium glutamicum, Kationenhomöostase, Natrium, Kalium German
Date of oral exam:	26 November 2014
Referee:	Name Academic Title Krämer, Reinhard Prof. Dr. Flügge, Ulf-Ingo Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/5929