Analyses of spinal muscular atrophy (SMA) modifiers and drug-dependent responses using motoneurons (MNs) derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs)

Heesen, Ludwig (2015). Analyses of spinal muscular atrophy (SMA) modifiers and drug-dependent responses using motoneurons (MNs) derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs). PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal-recessive neurological heredopathia caused by homozygous loss of the survival of motor neuron 1 (SMN1) gene. Although SMN protein is ubiquitously expressed as core part of the nuclear spliceosomal machinery, SMN depletion exerts its deleterious effects mainly in lower α-motoneurons of the spinal cord. The subsequent motoneuronal death and disruption of neuromuscular connectivity evokes de-nervation and atrophy of skeletal muscles in proximal limbs and trunk causing a high morbidity in affected infants. In humans there is naturally a second SMN gene copy (SMN2)present almost identical to SMN1. Notably, a C>T transition in exon 7 interrupts an important exonic splicing enhancer site in SMN2 nucleotide sequence. Consequently, diminished intron/exon border recognition frequently causes exon 7 skipping so that approximately 90% of total transcripts are shortened (Δ7-SMN isoform). Still, about 10% full-length SMN transcripts (FL-SMN) are produced per SMN2 gene copy ensuring a basal expression of fully functional FL-SMN protein even in SMN1-deleted SMA patients, after all. Variable numbers of SMN2 (2-6 copies) are present within the population and SMA patients due to high dynamics in this genomic region. Hence, the number of SMN2 copies inversely correlates with SMA severity. SMN2 was regarded as the sole genetic modifier in SMA until the discovery of actin bundling protein plastin 3 (PLS3) (Oprea et al. 2008). In rare “discordant” families, some individuals over-expressing PLS3 remain phenotypically asymptomatic despite sharing the same genotype as SMA affected siblings. Thus, PLS3 obviously acts as protective modifier in SMA. Findings in cell culture models as well as in zebrafish and mouse models proved PLS3-induced rescue of SMA-mediated deficits in respect of axonal outgrowth and NMJ maintenance. Yet, the ameliorating effects of PLS3 could not be directly investigated in motoneurons of discordant family members. The same problem occurred in examining the effects of SMA drugs such as histone deacetylase (HDAC) inhibitor valproic acid (VPA) (Brichta et al. 2006; Swoboda et al. 2011). However, not all SMA patients exhibited the desired SMN2 activation and elevation of blood FL-SMN levels pointing to a different responsiveness to VPA administration (Brichta et al. 2006; Piepers et al. 2011). The underlying molecular mechanisms remained elusive so far. The general infeasibility to obtain living neuronal tissue inheres in any neurological illness in humans. Therefore, introduction of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology (Takahashi et al. 2006) paved the way for the generation of individualised patient-derived in vitro cell culture models. Via ectopic over-expression of pluripotency-related transcription factors (OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC) human somatic target cells are reprogrammed into a pluripotent state displaying typical characteristics of naturally pluripotent embryonic stem cells (ESCs) (Takahashi et al. 2007). Directed re-differentiation of these iPSCs towards spinal motoneurons enables the generation of a patient-derived in vitro SMA model (Ebert et al. 2009). The goal of this doctoral thesis was to establish such a personalised iPSC-based in vitro cell culture model of PSL3-discordant family members as well as individuals with different responsiveness towards VPA.Fibroblasts of VPA responder/non-responder SMA patients as well as two PLS3 discordant SMA families (SMA III affected and their corresponding asymptomatic SMN1-deleted siblings)were successfully reprogrammed by classical retroviral 4F transduction or by application of state-of-the-art non-integrative Sendai virus. Subsequently, twelve iPSC lines were clonally expanded and subjected to standardised validation procedures affirming bona fide pluripotency in all iPSC lines, indeed. In addition, an optimised iPSC-derived embryoid body (EB)-based motoneuron differentiation protocol was set up with which patient-derived iPSCs were differentiated into human motoneuron (MNs) cultures lacking sufficient MN numbers for meaningful studies, however. Instead, generation of stable small molecule neural precursor cell (smNPC) lines provided a valuable tool in SMA studies representing a homogeneous cell population with high MN yield upon differentiation. Stringent examination of four phenotypic groups (i.e. healthy controls, SMA I and PLS3 discordant SMA III and asymptomatic siblings) in several different cell populations representing the iPSC-derived in vitro MN development (i.e. fibroblasts, iPSCs, smNPCs and MN cultures) enabled monitoring of cell-specific features during developmental course. Subsequent MN differentiation of correctly patterned smNPCs resulted in considerable yield of bona fide MN cultures stunningly displaying significant differences in MN survival rate with SMA I exhibiting a massive MN decline while SMA III and asymptomatic showed an intermediate MN number relative to control upon maturation. These findings perfectly matched patients’ respective phenotypes. Furthermore, SMN expression RNA and protein levels and concomitant gem numbers broadly mirrored familiar SMN1/SMN2 copy number distribution amongst phenotype classes with regard to principally known decreasing SMN expression in adult vs. foetal cells or in proliferating cells vs. post-mitotic cells: SMA I cultures indicated lowest SMN expression rates as well as fewest gem numbers in comparison to controls. In contrast, only a moderate reduction in gem numbers and SMN expression levels was found in SMA III and asymptomatic siblings relative to controls. In addition, PLS3 expression on RNA and protein levels depicted strong over-expression in neural lineages of asymptomatic siblings highlighting the importance of tissue-specific PLS3 over-expression for exertion of the protective effect in mild SMA III. Different neurite length was not observed among phenotype classes in early MN cultures. PLS3/actin co-localisation occured in neuronal growth cones of MN cultures. Co-culturing iPSC-derived motoneurons with human myotubes successfully established the initial prerequisites for studying deficits in neuromuscular synapse formation, a key feature of SMA pathology. Application of iPSCs successfully presented VPA response in GABAergic neuronal cultures of VPA (non)responders. Altered GABA release ultimately corroborated data disclosing membrane fatty acid transporter C36 as causative element in VPA responsiveness (Garbes et al. 2013). For the first time, this study profoundly and reliably recapitulated SMN deficiency-conditioned deficits in SMA diseased cell lines of different severity grades and healthy control at decisive steps of MN differentiation directly in the target tissue. Moreover, PLS3 expression course during MN development gave new insight into putative PLS3-mediated protection specifically in MN cultures of asymptomatic asymptomatic siblings. Additionally, similar VPA responsiveness as in fibroblasts and blood was verified in neuronal cultures.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Analysen von Spinaler Muskelatrophie (SMA)-Modifiern und Medikament-abhängigen Antworten in von induziert pluripotenten Stammzellen (iPSZ) abgeleiteten Motoneuronen (MN)	German

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Abstract

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Spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine verheerende autosomal-rezessive, neurodegenerative Erkrankung. Das verantwortliche Gen survival of motor neuron 1 (SMN1) ist bei den betroffenen Patienten homozygot deletiert. Obwohl das korrespondierende Protein SMN ubiquitär als Kernbestandteil der Spliceosom-Maschinerie exprimiert wird, entfaltet der SMNVerlust seinen schädlichen Effekt selektiv in den unteren α-Motoneuronen der ventralen Hörner des Rückenmarks. Der Untergang dieser Nervenpopulation und die folgende Unterbrechung der neuromuskulären Signalübertragung verursachen eine fortschreitende Denervierung mit progressivem Muskelschwund in der proximalen Skelettmuskulatur. Allerdings besitzen Menschen eine mit SMN1 fast identische Gen-Duplikation (SMN2). Bemerkenswerterweise zerstört eine C>T Transition im Exon 7 einen wichtigen exonischen Spleiß-Enhancer, woraufhin die verminderte Erkennung der Exon/Intron-Grenzen zu einem verstärkten Ausschluss von Exon 7 im Transkript (Δ7-SMN Isoform) führt. Daher fehlen in ungefähr 90% der SMN2-Transkripte Exon 7. Nichtsdestotrotz werden pro SMN2-Genkopie ca. 10-20% Volllänge-Transkript (FL-SMN) transkribiert, wodurch sogar in SMA-Patienten mit homozygoter SMN1-Deletion eine Grundexpression von funktionstüchtigem SMN-Protein gewährleistet wird. Die Lage von SMN2 in einer variablen Genomregion resultiert in einer variierenden Anzahl von SMN2-Kopien (2-6) in der Bevölkerung und bei SMA-Patienten. Somit korreliert die Anzahl der SMN2-Kopien umgekehrt mit dem Schweregrad der SMAErkrankung. SMN2 war lange Zeit deshalb der einzig bekannte genetische Modifier für SMA, bis in diesem Zusammenhang der protektive Effekt des actinbündelnden Proteins Plastin 3 (PLS3) entdeckt wurde (Oprea et al. 2008). In seltenen, sogenannten „diskordanten“ Familien zeigten einige Personen, die PLS3 überexprimierten, phänotypisch keine SMA-Symptome trotz desselben Genotyps wie ihre von SMA III betroffenen Verwandten. Studien in Tiermodellen und Zellmodellen bestätigten den durch PLS3-Überexpression induzierten Schutzeffekt. Allerdings konnte der Schutzeffekt von PLS3 nicht direkt in den Motoneuronen der Betroffenen untersucht werden. Dieselbe Problematik trat bei Studien potentieller Medikamente auf wie dem Histon-Deacetylase (HDAC) Hemmstoff Valproinsäure (VPS) (Brichta et al. 2003; Swoboda et al. 2011). Allerdings wiesen nicht alle Probanden die erwünschte stärkere SMN2 Transkription und einen höheren SMN Proteingehalt im Blut auf (Brichta et al. 2006; Piepers et al. 2011). Augenscheinlich sprachen SMA-Patienten unterschiedlich auf VPS-Behandlung an aufgrund unbekannter molekularen Ursachen. Da es generell unmöglich bleibt, Menschen eine Biopsie lebender Neuronen zu entnehmen, ist jedwede Studie über neurologische Erkrankungen durch diese Unzugänglichkeit des eigentlichen Zielgewebes behindert. Die Einführung der iPSZ-Technologie (induziert pluripotente Stammzellen) eröffnete dagegen die Möglichkeit, individuell patientenspezifische Krankheitsmodelle in vitro zu erstellen (Takahashi et al. 2006). Mittels ektopischer Überexpression von vier Pluripotenz aufrechterhaltenden Transkriptionsfaktoren (OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC) konnten humane somatische Zellen in einen pluripotenten Zustand reprogrammiert werden (Takahashi et al. 2007), der dem Zustand natürlich pluripotenter embryonaler Stammzellen (ESZs) glich. Eine gerichtete Re-Differenzierung dieser iPSZ zu spinalen Motoneuronen ermöglichte die Etablierung eines vom Patienten abgeleiteten in vitro SMA-Modells (Ebert et al. 2009). Das Ziel dieser Doktorarbeit lag in der Generierung eines ebenjenen personalisierten, iPSZ-basierten in vitro Zellkulturmodells von PLS3-diskordanten Familienmitgliedern sowie SMA-Patienten mit unterschiedlicher VPS-Reaktivität. Fibroblasten von VPS-Responder/-Nichtresponder SMA-Patienten wie auch zwei PLS3-diskordanten Familien (SMA III-Patienten sowie ihre asymptomatischen SMN1-deletierten Geschwister) wurden erfolgreich reprogrammiert mittels klassischer retroviraler 4F-Transduktion oder durch Anwendung des nicht-integrativen Sendai-Virus. Die erhaltenen zwölf iPSZ-Linien wurden klonal expandiert und einem standardisierten Validierungsprozess unterzogen zum Beweis echter Pluripotenz, den tatsächlich alle iPSZ-Linien erfüllten. Als weiteres Ergebnis dieser Arbeit wurde zusätzlich ein optimiertes, iPSZ-basiertes motoneuronales Differenzierungsprotokoll eingeführt, mit dem sich die Patienten-abgeleiteten iPSZ in Motoneuron (MN)-Kulturen differenzieren ließen, deren geringer MN-Gehalt weiterführende Untersuchungen jedoch beeinträchtigte. Statt dessen erbrachte die Generierung einer stabilen, homogenen neuralen Vorläuferzellpopulation (small molecule neural precursor cell, smNPCs) eine genügende MN-Ausbeute nach Differenzierung. Stringente Untersuchung von vier Phänotypklassen (d.h. gesunde Kontrollen, SMA I sowie PLS3-diskordante SMA III und asymptomatische Geschwister) in verschiedenen Zellpopulationen (Fibroblasten, iPSZ, smNPCs, MN-Kulturen) ermöglichten genauere Studien zell-spezifischer, SMA-bedingter Veränderungen während der in vitro MN-Differenzierung. Tatsächlich erbrachte die motoneuronale Differenzierung von smNPCs eine beträchtliche Menge echter MN, deren Anzahl signifikant und massiv bei SMA I abfiel nach fortgeführter Reifung, wohingegen die MN-Zahl der SMA III und asymptomatischen Geschwister einen mittleren Wert annahm relativ zur Kontrolle. Diese Resultate deckten sich perfekt mit den entsprechenden realen Phänotypen der Patienten. Ferner spiegelten die SMN-Expression sowie die damit einhergehende Anzahl der Gems die Anzahl der respektiven SMN1/SMN2-Genkopien unter den Phänotypklassen wider. Zudem stimmten die vorliegenden Daten mit denen vorheriger Studien überein hinsichtlich variierender SMN-Expression in adultem oder fötalen Gewebe oder verschiedenen Zellpopulationen. SMA I-Kulturen wiesen die niedrigsten SMN-Expressionsraten und die geringste Gem-Zahl auf im Vergleich zur Kontrolle. Dahingegen zeigten relativ zur Kontrolle SMA III und asymptomatische Geschwister lediglich eine milde Reduktion in puncto SMN-Menge und Gem-Zahl. Des weiteren förderte die Untersuchung der PLS3-Expression auf RNA- und Proteinlevel eine beachtliche Überexpression in neuralen Entwicklungslinien der asymptomatischen Geschwister zutage, was zusätzlich die offensichtliche Bedeutung einer gewebsspezifischen PLS3-Überexpression für einen protektiven Effekt hervorhob. Unterschiedliche Neuritenlängen innerhalb der phänotypklassen sind in jungen MN-Kulturen nicht gemessen worden. PLS3 und Actin ko-lokalisieren in Wachstumskegeln von Neuronen in MN-Kulturen. Indem man von iPSZ abgeleitete Motoneurone zusammen mit humanen Muskelzellen ko-kultivierte, wurden die Grundvoraussetzungen für eine erfolgreiche Untersuchung von Defiziten in der neuromuskulären Synapsenbildung geschaffen – einem Kernmerkmal der SMA-Pathologie. Erfolgreich wurden iPSZ außerdem angewandt, um VPS-bedingte Veränderungen bei der GABA-Ausschüttung Neuronenkulturen von VPS-Respondern/Nichtrespondern zu verifizieren. Diese Daten untermauerten letztlich die verantwortliche Rolle des membranständigen Fettsäuretransporters CD36 hinsichtlich der abweichenden VPS-Wirkung bei SMA-Patienten (Garbes et al. 2013). Zum ersten Mal überhaupt rekapitulierte die vorliegende Studie in profunder und verlässlicher Weise die durch SMN-Defizienz bedingten Defizite bei SMA-Zelllinien mit verschiedenen Krankheitsschweregraden sowie bei gesunden Kontrollen an entscheidenden Punkten der motoneuronalen Entwicklung direkt im Zielgewebe. Ferner hob der PLS3-Expressionsverlauf während der MN-Differenzierung schlüssig die Rolle des mutmaßlichen, PLS3-vermittelten Schutzes speziell in MN-Kulturen asymptomatischer Geschwister hervor.

German

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