Universität zu Köln

Schmied, Sabine (2014). Characterization of tumor-antigen-specific T cells - insights into WT1- and HPV16-specific T cell repertoires. PhD thesis, Universität zu Köln.

Preview

PDF (Dissertation) 150304_PhD_Thesis_Sabine_Schmied.pdf - Published Version Download (7MB)

Abstract

This thesis provides characterization of rare tumor-associated antigen (TAA)-specific T cells concerning their in vivo prevalence, functionality, and phenotype in healthy and diseased individuals. Such knowledge on the existing in vivo repertoire is crucial for the understanding of T cell immunity towards tumors and furthermore for the utilization of TAA-specific T cells in immunotherapeutic approaches. Thus far, low frequencies of such TAA-specific T cells in blood and tissues hindered an in-depth characterization, even in tumor patients. Here, we establish and implemented highly sensitive methods, based on magnetic enrichment of TAAspecific T cells in combination with a multiparameter flow cytometry analysis to overcome existing sensitivity hurdles and allow ex vivo description of the T cells. Two different activation markers were implemented, CD154 (CD40L) for ex vivo enumeration and characterization of blood CD4+ T cells, and CD137 (4-1BB) for subsequent characterization of rare antigen-specific CD4+ and CD8+ T cell subsets from blood and tumor tissue after a short-term in vitro expansion. On the one hand, T cells specific for the self-antigen WT1 and, on the other hand, T cells specific for the viral antigens HPV16 E6 and E7 were investigated. The Wilms’ tumor 1 (WT1) protein is a transcription factor expressed at high levels in several hematological malignancies and some solid tumors and is considered a prime target for cancer immunotherapy. Remarkably, in this study, WT1-specific CD4+ and CD8+ T cell populations were detected in the vast majority of healthy individuals. Memory responses specific for WT1 were commonly present in the CD4+ T cell compartment, whereas WT1specific CD8+ T cells almost universally displayed a naïve phenotype. Moreover, WT1specific memory CD4+ and naïve CD8+ T cells were found to co-exist in healthy individuals. Collectively, these findings suggest a natural discrepancy between the CD4+ and CD8+ T cell lineages responsive to self-antigens with respect to memory formation. Nonetheless, WT1specific T cells from both lineages were readily activated ex vivo and expanded in vitro, supporting the general use of strategies to exploit this expansive reservoir of self-reactive T cells for immunotherapeutic purposes. Furthermore, characteristics of HPV16-specific T cells were investigated in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) patients, as HNSCC is frequently induced by HPV16 infection. This study revealed that HPV16-specific T cells in the blood of HPV16pos HNSCC patients exhibit profound differences in prevalence, functionality, and phenotype between individuals. While all patients harbored HPV-specific T cells in peripheral blood, we identified a subgroup of patients with significantly elevated frequencies of functional effector memory HPV16-specific CD4+ T cells compared to other patients. Moreover, these high responder patients had a more active anti-tumor immunity in comparison to low responders. Despite these variations, HPV16-specific T cells with functional capacities could be isolated and propagated both from blood and tumor tissue of all HPV16pos HNSCC patients. Furthermore, this data supports the notion that HPV16-reactive tumor infiltrating lymphocytes were suppressed by intratumoral Treg cells, the depletion of which restored T cell effector functions and facilitated expansion of reactive T cells for therapeutic use. In summary, the techniques established in this study permit detection of rare antigen-specific T cells and therefore are superior to common immune monitoring methods in terms of sensitivity and determination of T cell properties. In particular, these techniques were implemented to provide novel insights into the naturally occurring repertoire of WT1- and HPV16-directed T cells. These findings support the use of WT1- and HPV16-specific T cells in immunotherapy and provide knowledge crucial for the optimal design of WT1- and HPV16directed immunotherapeutic interventions.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Diese Arbeit umfasst eine Charakterisierung in Bezug auf Prävalenz, Funktionalität und Phänotyp von den sehr seltenen T-Zellen, die spezifisch für Tumor-assoziierte Antigene (TAA) sind. Wissen über das in vivo existierende T-Zellrepertoire ist für das Verständnis der Immunität gegenüber dem Tumor und darüber hinaus für die Entwicklung von immuntherapeutischen Ansätzen notwendig. Eine solche detaillierte Charakterisierung war bislang nicht möglich, da TAA-spezifische T-Zellen im Blut und im Tumor nur in sehr geringer Frequenz vorliegen. In dieser Arbeit werden hoch sensitive Methoden etabliert, basierend auf magnetischer Anreicherung von TAA-spezifischen T-Zellen in Kombination mit einer Analyse mittels Multiparameter-Durchflußzytometrie, die die bisher bestehenden Sensitivitätsgrenzen überwinden und damit die ex vivo Charakterisierung der T-Zellen zulassen. Zwei Aktivierungsmarker kamen für die Zellanreicherung zum Einsatz; zum einen wurde CD154 (CD40L) zur ex vivo Enumeration und Charakterisierung von CD4+ T-Zellen aus dem Blut benutzt und zum anderen wurde CD137 (4-1BB) für die Charakterisierung von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellpopulationen aus Blut und Tumorgewebe nach einer kurzen in vitro Expansion eingesetzt. Im Speziellen wurden T Zellen untersucht, die spezifisch für das Selbstantigen WT1 sind, und T Zellen, die spezifisch für das E6 und E7 Antigen des humanen Papillomavirus Typ 16 (HPV16) sind. Das Wilms’ Tumor 1 (WT1) Protein ist ein Transkriptionfaktor, der im hohen Maße in hämatologischen Tumoren und einigen soliden Tumoren exprimiert wird. WT1 gilt als geeignetes Zielantigen für die Immuntherapie. Erstaunlicherweise konnten in dieser Studie WT1-spezifische CD4+ und CD8+ T-Zellen im Blut von der Mehrheit der gesunden Spender detektiert werden. Eine Gedächtnisantwort, die spezifisch gegen WT1 gerichtet ist, war häufig im CD4+ T-Zellkompartiment zu finden, während WT1-spezifische CD8+ T-Zellen fast ausschließlich einen naiven Phänotyp zeigten. Darüber hinaus wurde die Koexistenz von WT1-spezifischen Gedächtnis CD4+ und naïve CD8+ T-Zellen in einem Individuum nachgewiesen. Zusammenfassend implizieren die Resultate, dass eine Diskrepanz in der Entwicklung von Gedächtnisantworten zwischen den CD4+ and CD8+ T-Zellkompartimenten, die auf Selbstantigen reagieren, vorliegt. Dennoch ließen sich WT1-spezifische T-Zellen aus beiden Kompartimenten in vitro aktivieren und expandieren. Dieses spricht für die Umsetzung von Strategien, die das Repertoire von Selbstantigen-spezifischen T-Zellen für immuntherapeutische Ansätze nutzen. Des Weiteren wurden HPV16-spezifische T-Zellen in Patienten mit Kopf-Hals-Tumor (head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC) untersucht, da HNSCC häufig durch HPV16 Infektion induziert wird. Die vorliegende Arbeit zeigt auf, dass die Häufigkeit, die Funktionalität und der Phänotyp von HPV16-spezifischen T-Zellen im Blut sich deutlich zwischen den HPV16pos HNSCC Patienten unterscheiden. Während in allen Patienten spezifische T-Zellen nachweisbar sind, konnte ein Gruppe von HPV16pos HNSCC Patienten identifiziert werden, die eine auffällig hohe Frequenz an HPV16-spezifischen EffektorGedächtnis-CD4+ T-Zellen mit hoher Funktionalität aufweist. In diesen ‚high responder’ Patienten war darüber hinaus eine aktivere Anti-Tumorimmunität im Tumorgewebe zu finden als in den ‚low responder’ Patienten. Trotz dieser Unterschiede konnten HPV16-spezifische T-Zellen sowohl aus Blut als auch aus Tumorgewebe von HPV16pos HNSCC Patienten gewonnen werden. Dennoch verdeutlichen die Daten, dass Treg im Tumorgewebe die Aktivität der HPV16-spezifischen Tumor-infiltrierender Lymphozyten abschwächen, denn das Eliminieren von Treg aus den in vitro gewonnenen tumor-infiltrierenden Lymphozyten führte zur einer deutlich verstärkten Effektorfunktion und Expansion von HPV16-spezifischen T-Zellen. Die in dieser Arbeit etablierten Methoden ermöglichen eine detaillierte Charakterisierung von sehr seltenen tumor-spezifischen T-Zellen und sind damit bislang üblichen Methoden des Immunmonitoring an Sensitivität und Informationsgehalt überlegen. Insbesondere wurden mittels der etablierten Methoden neue, tiefreichende Erkenntnisse über die T-Zell-Immunität gegenüber WT1 und HPV16 gewonnen. Die erzielten Daten sprechen für die immuntherapeutische Nutzung von WT1- und HPV16-spezifischen T Zellen und stellen wichtige Erkenntnisse für die optimale Gestaltung von WT1- und HPV16-basierten Immuntherapien bereit. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Schmied, Sabine s_schmied@hotmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-60723
Date:	26 November 2014
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Zentrum für Molekulare Medizin
Subjects:	Natural sciences and mathematics Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language antigen-specific T cell, tumor-Antigen, WT1, HPV16,Immunotherapy English Antigen-spezifische T Zelle, Tumorantigen, WT1, HPV16, Immuntherapie German
Date of oral exam:	23 February 2015
Referee:	Name Academic Title Abken, Hinrich Prof. Dr. med. Wunderlich, Thomas PD Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6072