Universität zu Köln

Das hoch konservierte Peptidhormon Insulin ist im menschlichen Körper ein zentraler Regulator der Energiehomöostase. Verschiedene großangelegte -omics-Studien untersuchten intrazelluläre Insulinsignalwege, beispielsweise die durch Insulin regulierte Glukoseaufnahme, Genregulation oder Zelldifferenzierung. Dabei wurde eine Vielzahl Insulin-abhängiger Effektoren entdeckt und komplexe Interaktionsmechanismen zwischen diesen Signalmolekülen erkundet. Für die meisten der neu entdeckten Signalmoleküle blieben jedoch die genaue Funktionen innerhalb der Signalwege ungeklärt. Des weiteren zeigte sich, dass die Interaktionen zwischen den verschiedenen Signalwegen weitaus komplizierter verlaufen, als angenommen wurde. Ziel dieser Dissertation ist daher das Erstellen eines detailierten Protein-Protein Interaktionsnetzwerkes, sowie eines Phosphoproteoms nach Insulinstimulierung um komplexe, Insulin-abhängige Signalwege in braunen Adipozyten zu erkunden. Für das Erstellen des globalen Interaktionsnetzwerkes wurden mehr als 100 Proteine ausgewählt, welche entweder bekannte Funktionen in Insulinsignalwegen besitzen oder in Abhängigkeit von Insulin phosphoryliert werden. Zum Anreichern potentieller Interaktoren wurden braune Adipozyten transient mit den ausgewählten, FLAGmarkierten Kandidaten transfiziert und nach Immunprezipitation und hochauflösender massenspektrometrischer Analyse mithilfe verschiedener bioinformatischer Methoden statistisch analysiert. Dabei wurden 4,197 verschiedene binäre Interaktionen mit 95 verschiedenen Proteinkandidation identifiziert, wobei 3,815 dieser Interaktionen ein dynamisches und Insulin-abhängiges Verhalten aufwiesen. Des Weiteren wurde deutlich, dass durch den Insulinstimulus verschiedene Proteinmotive angereichert werden und sich Proteininteraktionsgemeinschaften dynamisch verändern. In dem Insulin-stimulierten Phosphoproteom wurden insgesamt 2,334 signifikant regulierte Phosphorylierungstellen identifiziert, wobei 46 der ausgegälten Proteinkandidaten und 319 Interaktoren ebenfalls Phosphorylierungsstellen aufwiesen. Eine vergleichende Analyse der Interaktions- und Phosphorylierunsdynamiken identifizierte 2,010 Kandidaten mit positiv oder negativ korrelierenden Phosphorylierungen verglichen zu Interaktionsdynamiken, die darauf hinweisen, dass die identifizierten Proteinphosphorylierungen bestimme Interaktion in Abhängigkeit zu Insulin fördern oder inhibieren können. Durch die Korrelation vi dieser Insulin-abhängigen Datensätze konnten verschiedene Proteine mit bisher unbekannter Funktion im Insulinsignalweg im selbigen eingeordnet werden. Mehrere Interaktionskandidaten, nämlich RAI14, SHC3, NCK1 und SH3BP4, interagierten mit Proteinen, die sowohl am Umbau des Zytoskeletts als auch der Vesikeltranslokation beteiligt sind. Weitere Kandidaten konnten Insulin-stimulierten Prozessen wie dem Fettsäuremetabolismus (CERS1) oder mRNA-Translokation und Translation (ZC3H11A) zugewiesen werden. Generell kann der hier präsentierte Arbeitsablauf auch für die Analyse anderer Zellkultursysteme nach Stimulation verwendet werden und ist daher eine unabhängige Plattform zur Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen. Des Weiteren können die hier gesammelten Daten als Datenbank verwendet werden, um Insulin-abhängige Dynamiken in braunen Adipozyten zu studieren und Proteine, die bisher nicht dem Insulinsignalweg zugeordnet worden waren, funktionell zu charakterisieren und einzuordnen.

UNSPECIFIED