Universität zu Köln

Kantzer, Christina Geraldine (2015). Astrocyte cell surface marker phenotyping: Identification of multipotent ACSA-2-/GLAST+ cerebellar progenitor cells. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Astrocytes, a member of the glial cell family, are the most abundant neural cell type of the central nervous system (CNS) and present functional and morphological heterogeneity. Among other characteristics, astrocytes provide trophic functions, are essential for the formation of the blood-brain barrier, regulate ion homeostasis, synaptogenesis and synaptic plasticity. Despite their diversity astrocyte subpopulations are not well characterized mainly due to the lack of markers that could classify functional subclasses. This study aimed at the phenotyping of astrocyte subpopulations based on cell surface marker expression, their prospective isolation and subsequent molecular and cellular characterization of the identified subsets. The glutamate aspartate transporter (GLAST) is a common astrocyte marker expressed by astrocytes in the CNS. As the GLAST antibody allows for the isolation of astrocytes it was chosen as principal component for the identification of astrocyte subpopulations. One approach, which was not successful, was the generation of novel monoclonal astrocyte subpopulation specific antibodies using GLAST isolated astrocytes and hybridoma techniques. Another approach was the identification of novel astrocyte markers by flow cytometry. 232 cell surface markers were tested for their expression on astrocytes. In total, 15 candidates were identified and subsequently validated by immunohistochemistry (IHC) and the recently established in house technology: Multidimensional In Situ Cytometry Survey (MICS). The expression profile and the nature of the target of the novel Anti-ACSA-2 (ACSA: astrocyte cell surface antigen) antibody were addressed. In co-operation with the group of Dr. Harold Cremer at the Institut de Biologie du Développement de Marseille, the expression profile of the ACSA-2 antigen was analyzed systematically using IHC, immunocytochemistry (ICC), MICS and flow cytometry. Co-expression of ACSA-2 with common astrocyte markers such as GFAP, S100β and GLAST and missing expression on neurons, oligodendrocytes validated ACSA-2 as an astrocyte specific marker. Additional Western Blot analysis, immunoprecipitation and deglycosylation assays pointed out the ACSA-2 antibody addresses a glycosylation structure expressed by astrocytes. In the next step, the expression profile of ACSA-2 and GLAST was investigated in comprehensive analyses of embryonal, neonatal and adult mouse brain using IHC, ICC, MICS, and flow cytometry. ACSA-2 and GLAST demonstrated differential marker expression in distinct brain regions, retina and spinal cord of neonatal mice. Additional studies addressed ACSA-2 and GLAST expression on neural stem cells. The expression of ACSA-2 in the subventricular zone (SVZ) was analyzed using IHC, in vivo electroporation and flow cytometry. ACSA-2 was demonstrated to be co-expressed with GLAST in the adult SVZ as shown by IHC and flow cytometry. Differences between ACSA-2 and GLAST expression were also identified in the rostral migratory stream (RMS) and hippocampus of the adult mouse brain. However, these differences could not be confirmed on the single cell level by flow cytometry. Cerebellar glia revealed significant differences in GLAST and ACSA-2 expression in the adult mouse brain. To address the origin of these potential subpopulations GLAST and ACSA-2 expression was monitored between E13 and P12 in the developing cerebellum. Thereby, ACSA-2-/GLAST+ and ACSA-2+/GLAST+/- cells were identified. Populations were most discriminative between E17 to P3 and frequencies of ACSA-2-/GLAST+ cells decreased with the onset of development. Both fractions were isolated to high purities by magnetic cell sorting. Cell characteristics were addressed by ICC, neurosphere assay, gene expression profiling and transplantation assay. Cell differentiation in vivo was investigated in collaboration with the group of Dr. Annalisa Buffo at the Neuroscienze Institute Cavalieri Ottolenghi in Turin. ACSA-2-/GLAST+ and ACSA-2+/GLAST+/- cells were isolated from the cerebellum of P0-P3 β-actin GFP mice and grafted into cerebellum of homochronic wild-type mice. ACSA-2-/GLAST+ cells were able to differentiate into interneurons (stellate and basket cells), Bergmann glia, astrocytes and oligodendrocytes. In contrast, ACSA-2+/GLAST+/- cells only differentiated into astrocytes and oligodendrocytes. Gene expression profiling was performed to address differences on the transcriptome level. Genes related to a multipotent and GABAergic phenotyp were enriched in the ACSA-2-/GLAST+ sample set (Gli1, Wif1, Nestin, Ptf1a, Ascl-1). Genes involved in cell-cell interactions as well as cell matrix proteins (Gjb2, Gjb6, Gja1, Vitronectin) were enriched in the ACSA-2+/GLAST+/- sample set. In conclusion, this study presents a regional, functional and molecular discrimination of astrocyte subpopulations based on specific cell surface markers. As a result it describes the identification of a novel ACSA-2-/GLAST+ subpopulation of astrocytes which act as multipotent progenitors in the cerebellum.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Astrozyten gehören zu den Gliazellen. Sie sind der häufigste Zelltyp im zentralen Nervensystem und besitzen morphologische und funktionelle Divergenz. Astrozyten sind nicht nur wichtige Metabolit Lieferanten, sondern auch ein Bestandteil der Blut-Hirn-Schranke. Sie regulieren Ionenkonzentrationen, sind an der Synaptogenese beteiligt und steuern synaptische Plastizität. Trotz ihrer Diversität sind Astrozytensubpopulationen bisher kaum funktionell charakterisiert. Dies liegt im Wesentlichen an der eingeschränkter Verfügbarkeit von geeigneten Markern. Ziel dieser Studie war die Phänotypisierung von Astrozytensubpopulationen anhand von Zelloberflächenmarkern. Mit Hilfe von magnetischer Zellsortierung sollten die Subtypen isoliert und anschließend funktionell und molekular untersucht werden. Der Astrozytenmarker GLAST ist ein Glutamat Aspartat Transporter, der von Astrozyten im ZNS exprimiert wird. Durch Verwendung eines für GLAST spezifischen Antikörpers können diese Zellen gezielt isoliert werden. Aus diesem Grund wurden GLAST positive Astrozyten als Ausgangspunkt für die Untersuchungen dieser Arbeit definiert. In einem Ansatz wurden GLAST positive Astrozyten isoliert, um mit Hilfe von Hybridomzelltechniken neue Antikörper gegen Astrozytensubpopulationen zu erhalten. Die Generierung von neuen Antikörpern war jedoch nicht erfolgreich. Ein weiterer Ansatz war die Identifikation von neuen Astrozytenzelloberflächenmarkern. Dieser Ansatz basierte auf einem durchflusszytometrischen Screening einer Antikörperbibliothek. Es wurden ingesamt 232 Zelloberflächenmarker auf ihre Expression auf Astrozyten getestet. In diesem Experiment wurden 15 Marker identifiziert, die anschließend mit Hilfe von Immunhistochemie (IHC) und Multidimensional In Situ Cytometry Survey (MICS) validiert wurden. In einem Parallelansatz wurde das Expressionsprofil und das Antigen des Anti-ACSA-2 (ACSA: Astrozytenzell-oberflächenantigen) Antikörpers untersucht. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Harold Cremer am Institut de Biologie du Développement de Marseille wurde das Expressionsprofil von ACSA-2 über IHC, Immunzytochemie (ICC), MICS sowie per Durchflusszytometrie untersucht. Durch die Koexpression von ACSA-2 mit diversen Astrozytenmarkern konnte ACSA-2 als Astrozyten spezifischer Marker bestätigt werden, der nicht von Neuronen, Oligodendrozyten oder anderen nicht-astrozytären Zellen exprimiert wird. Western Blot Analysen, Immunprezipitationen und Deglykosylierungs assays deuteten darauf hin, dass der Anti-ACSA-2 Antikörper eine Zuckerstruktur auf Astrozyten erkennt. In weiterführenden Untersuchungen wurde das Expressionsprofil von GLAST und ACSA-2 auf embryonalem, neonatalem und adultem Maushirn mittels IHC, ICC und per Durchflusszytometrie getestet. ACSA-2 und GLAST zeigten ein unterschiedliches Expressionsprofil in verschiedenen Hirnregionen, in der Retina und im Rückenmark von neonatalen Mäusen. Es folgten weitere Expressionsanalysen von GLAST und ACSA-2 in Stammzellregionen. Die Expression von ACSA-2 in der subventrikulären Zone (SVZ) wurde anhand von IHC, in vivo Elektroporation und Durchflusszytometrie untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass GLAST und ACSA-2 in der adulten SVZ koexprimiert vorliegen. Unterschiedliche Expressionsmuster wurden ferner im rostral migratory stream und im Hippocampus von adulten Maushirnschnitten detektiert. Jedoch war es nicht möglich, die Unterschiede auf Einzelzellebene zu bestätigen. Signifikante Expressionsunterschiede zwischen GLAST und ACSA-2 wurden im Cerebellum von adulten Maushirnschnitten identifiziert. In anschließenden Untersuchungen wurde die Herkunft dieser Zelltypen in der cerebellaren Entwicklungsphase (E13-P12) analysiert. Hierbei wurde eine ACSA-2-/GLAST+ und eine ACSA-2+/GLAST+/- Zellpopulation identifiziert. Die größten Expressionsunterschiede lagen zwischen E17 und P3 vor. Zudem sank die Frequenz an ACSA-2-/GLAST+ Zellen in der weiteren Entwicklung. Beide Zellpopulationen wurden per magnetischer Zellsortierung mit hoher Reinheit angereichert und anschließend mittels ICC, Neurosphere assay, Genexpressionsanalysen und Zelltransplantation untersucht. Zudem wurde ein in vivo Zelldifferenzierungs Assay mit isolierten ACSA-2-/GLAST+ und ACSA-2+/GLAST+/- Zellen aus dem Cerebellum von β-actin GFP Mäusen durchgeführt. Diese Experimente fanden in Kollaboration mit der Arbeitsgruppe von Dr. Annalisa Buffo am Neuroscienze Institute Cavalieri Ottolenghi in Turin statt. Die Analyse zeigte, dass ACSA-2-/GLAST+ Zellen in Interneurone, Bergmann glia, Astrozyten and Oligodendrozyten differenzieren konnten. Im Gegenzug, konnten ACSA-2+/GLAST+/- Zellen nur in Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren. Genexpressionsanalysen beider Zellgruppen zeigten, dass Stammzellfaktoren und Gene für einen GABAergen Phänotyp in den ACSA-2-/GLAST+ Proben angereichert waren (Gli1, Wif1, Nestin, Ptf1a, Ascl-1). Gene, die Zellinteraktion und Zelladhäsion kodieren (Gjb2, Gjb6, Gja1, Vitronectin), waren in den ACSA-2+/GLAST+/- Proben angereichert. Zusammenfassend zeigt diese Studie eine regionale, funktionale und molekulare Charakterisierung von Astrozyten anhand von Zelloberflächernmarkern. Anhand dieser Charakteristika wurde eine neue ACSA-2-/GLAST+ multipotente Zellvorläuferpopulation im Cerebellum identifizieren. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Kantzer, Christina Geraldine UNSPECIFIED UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Corporate Contributors:	Miletenyi Biotec GmbH
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-61982
Date:	19 June 2015
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Astrocyte surface marker expression UNSPECIFIED Cerebellar stem and precursor cells UNSPECIFIED
Date of oral exam:	19 June 2015
Referee:	Name Academic Title Rugarli, Elena I. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6198