Roughex dependent regulation of the Drosophila cell cycle - Kölner UniversitätsPublikationsServer

Foley, Edan (2001). Roughex dependent regulation of the Drosophila cell cycle. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Orderly progression through the cell cycle is essential for the correct development and survival of all eukaryotes. DNA replication during S phase and cell division at mitosis are driven by a conserved family of kinases, the cyclin-dependent kinases (CDKs). CDKs are dowregulated by a number of different mechanisms, such as inhibitory phosphorylation, cyclin proteolysis and direct inhibition by cyclin-dependent kinase inhibitor (CKI) proteins. In Drosophila, the Roughex (Rux) gene product prevents premature S phases by inhibiting CycA-dependent kinase activity. Here, it is shown that Rux fulfills all the criteria that define proteins as CKIs. rux overexpression inhibits mitosis. Rux physically associates with CycA and CycB, inhibits Cdk1 dependent kinase activity and prevents Cdk1 activation. Rux does not inhibit Cdk2/CycE and overexpression of rux does not prevent CycE dependent S phases. Thus, Rux is a Drosophila CKI specific for mitotic cyclins. This is the first such CKI to be described in a multicellular organism. In addition to G1 maintenance Rux also plays a role in mitotic exit. Observations of fixed and living embryos show that metaphase is significantly longer in rux mutants than in wild-type embryos. In addition, Rux overexpression is sufficient to drive cells experimentally arrested in metaphase into interphase. Furthermore, rux mutant embryos are impaired in their ability to overcome a transient metaphase arrest induced by expression of a stable CycA. Rux has numerous functional similarities with Sic1. While these proteins share no sequence imilarity, Sic1 inhibits mitotic Cdk1-cyclin complexes from Drosophila in vitro and in vivo. Rux is stable during most of the cell cycle, with the exception of the G1 to S phase transition where it is destroyed by the proteasome. Rux destruction relies on a PEST sequence in the C-terminus of the protein. Based on the results described above the following model is proposed for Rux function; Rux is a Drosophila CKI specific for mitotic cyclins that inhibits Cdk1/CycA activity during metaphase and maintains this activity at a low level during G1. Rux is destroyed by the proteasome at transition into S phase, liberating CycA to perform S phase functions.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Ein normaler Ablauf des Zellzyklus ist essentiell für die korrekte Musterbildung und das Überleben eines Eukaryontens. Zwei Schlüsselereignisse im Zellzyklus, die DNA Replikation während S phase und die Chromatidsegregation während der Mitose, werden von einer konservierten Kinasefamilie, den Cyclin Dependent Kinases (CDKs), katalysiert. Während der Evolution sind mehrere Mechansimen entstanded, die die CDK Aktivität kontrollieren; kovalente Modifikation von CDKs, Cyclinproteolyse und CDK/Cyclin Inhibition durch die sogennanten CDK Inhibitors (CKIs). Das Produkt des Drosophilagens Rux inhibiert CycA abhängige Aktivität aktivität und verhindert dadurch einen frühzeitigen Eintritt in die S Phase während der Augenentwicklung. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Rux ein Drosophila CKI ist. Rux assoziert mit den mitotischen Cyclinen A und B und seine Überexpression im Embryo verhindert die Mitose. Die in dieser Arbeit beschriebenen in vitro Experimente zeigen, dass Rux die Aktivität von Cdk1/CycA und Cdk1/CycB Komplexen inhibieren, aber auch die eigentliche Aktivierung von Cdk1 verhindern kann. Die Aktivität des Cdk2/CycE Komplexes wird in diesen Experimenten nicht inhibiert und die Überexpression von Rux in Embryonen stört die CycE abhängigen S-Phasen nicht. Interesanterweise ist Rux die erste CKI spezifisch für mitotische Cycline, die in einem multizellülarem Organismus characterisiert worden ist. In dieser Arbeit wird auch gezeigt, dass das Rux Genprodukt eine Rolle in der Mitose spielt. Die Metaphase in rux Mutantendauert länger . Rux Überexpression kann einen Metaphase-Arrest aufheben, der durch Expression von stabilem CycA hervorgerufen wird und rux Mutanten zeigen eine veringerte Fähigkeit die Metaphase nach Überexpression von stabilem CycA zu verlassen. Rux trägt also zur Metaphase zu Anaphase Transition durch die Inhibition von Cdk1/CycA Aktivität bei, dass heisst in einer Weise, die nicht von der CycA Proteolyse abhängt. Eine ähnliche Funktion ist schon für den S. cerevisiae CKI, SIC1 gezeigt worden. Diese Arbeit zeigt, dass SIC1 überexpression in Drosophila Mitose und die Cdk1/CycA und Cdk1/CycB Komplexe inhibieren kann. Dies deutet auf eine funktionele Ähnlichkeit zwischen Sic1p und Rux deutet. In dieser Arbeit wird zusätzlich gezeigt, dass Rux in G1 Zellen stabil ist und vom Proteasom vor der S Phase abgebaut wird. Rux abbau is durch ein PEST Sequenz im C-terminus des Proteins bestimmt. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse wird folgendes Model für die Funktion von Rux vorgeschlagen; Rux ist ein Drosophila CDK Inhibitor mit einem spezifität für mitotischen Cycline, der die Cdk1/CycA Aktivität während der Metaphase inhibiert und diese Aktivität auch in der G1 phase auf einem niedrigen Niveau hält. Rux wird vom Proteasom vor der S phase abgebaut, und dies ist eine Voraussetzung für die Accumulation von CycA abhängiger Kinaseaktivität.

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