Universität zu Köln

Pabst, Stefan ORCID: 0000-0003-1073-4246 (2021). Analysis of SUMO-protein modification and its effect on cellular processes. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Conjugation of SUMO (small ubiquitin-related modifier) to a substrate protein is a posttranslational modification, which can have various consequences on the substrate’s activity, localization and stability. Structurally very similar to ubiquitin, SUMO is attached to a substrate in a similar enzymatic cascade, but in contrast, SUMO is not an immediate degradation signal for the substrate. However, ULS (ubiquitin ligases for sumoylated proteins) negatively regulate the abundance of SUMO conjugates by ubiquitylation which in turn leads to proteasomal degradation. Additionally, the desumoylating enzymes, in S. cerevisiae primarily Ulp2, negatively control the length of SUMO chains. Preliminary experiments from our laboratory have demonstrated that a failure in the control of sumoylation causes mitochondrial fragmentation. Dnm1 is the key enzyme for mitochondrial fission and it is known that sumoylation regulates the activity of its human ortholog Drp1. Motivated by these reports, a starting question was whether Dnm1 is sumoylated as well. In order to answer this question, various methods for the analysis of SUMO conjugates were established and applied. One of these methods was the application of cleavage-resistant SUMO variants, carrying the mutation Q95P, for the stabilization of these conjugates. Furthermore an optimized protocol for denaturing purification of SUMO and ubiquitin conjugates was established. In the following, this purification method was the basis for an approach to identify sumoylation sites by the application of the mass spectrometry optimized variant 8H-Smt3-KallR-I96R. In addition to identifying new SUMO substrates (for example the (Na+, K+)/H+ antiporter Vnx1), this analysis revealed N-terminal modification of SUMO, presumably by ubiquitin. From a more physiological point of view, the effect of the SUMO system on Dnm1 localization was investigated. Generation of a Ulp2 variant with a low-temperature degron and application of an improved mtGFP construct revealed that fragmentation of mitochondria occurs in the course of one day at restrictive temperature and is therefore probably a consequence of the accumulation of sumoylated proteins. Furthermore, it was discovered that specifically in the strain dnm1∆ fzo1∆, defective in mitochondrial dynamics, the absence of ULS leads to an increase in the formation of petite colonies. This in turn suggests that in particular in the absence of the mitochondrial quality control systems of fission and fusion, ULS are important to ensure respiratory competence. Regarding Dnm1 itself, a ubiquitylation of this protein could be demonstrated. However, at the same time under the applied conditions, a sumoylation of Dnm1 seems to be unlikely. Cdc11 could be successfully employed as a known SUMO substrate which confirmed the general capability of the applied methods. In agreement with the detection of ubiquitylated forms, it was found that Dnm1 is degraded via the ubiquitin-proteasome system. Furthermore, ethanol was discovered as a treatment that leads to degradation of Dnm1. Summarized, the methods established in the course of this study will be useful tools for the analysis of SUMO conjugates, and the finding of ubiquitylated Dnm1 could be a starting point for further analysis of this modification in respect to mitochondrial dynamics.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Analyse der SUMO-Proteinmodifikation und ihrer Auswirkungen auf zelluläre Prozesse German
Translated abstract:	Abstract Language Die Konjugation von SUMO (small ubiquitin-related modifier) an ein Substratprotein ist eine posttranslationale Modifikation, die verschiedene Auswirkungen auf die Aktivität, Lokalisierung und Stabilität des Substrats haben kann. Strukturell sehr ähnlich zu Ubiquitin, wird SUMO in einer vergleichbaren enzymatischen Kaskade an ein Substrat gebunden, aber im Gegensatz dazu ist SUMO kein unmittelbares Abbausignal für das Substrat. Allerdings regulieren ULS (ubiquitin ligases for sumoylated proteins) die Menge der SUMO-Konjugate durch Ubiquitylierung, was wiederum zum proteasomalen Abbau führt. Zusätzlich regulieren die desumoylierenden Enzyme, in S. cerevisiae vor allem Ulp2, die Länge der SUMO-Ketten. Vorläufige Experimente in unserem Labor haben gezeigt, dass ein Versagen der Kontrolle von Sumoylierung zur mitochondrialen Fragmentierung führt. Dnm1 ist das Schlüsselenzym für die mitochondriale Teilung und es ist bekannt, dass die Sumoylierung die Aktivität seines menschlichen Orthologs Drp1 reguliert. Ausgehend von diesen Arbeiten stellte sich die Frage, ob auch Dnm1 sumoyliert ist. Um diese Frage zu beantworten, wurden verschiedene Methoden zur Analyse von SUMO-Konjugaten entwickelt und angewendet. Eine dieser Methoden war der Einsatz von nicht-spaltbaren SUMO-Varianten, die die Mutation Q95P tragen, zur Stabilisierung dieser Konjugate. Außerdem wurde ein optimiertes Protokoll für die denaturierende Aufreinigung von SUMO- und Ubiquitin-Konjugaten entwickelt. Diese Aufreinigungsmethode bildete im Folgenden die Grundlage für einen Ansatz zur Identifizierung von Sumoylierungsstellen durch Anwendung der massenspektrometrisch optimierten Variante 8H-Smt3-KallR-I96R. Neben der Identifizierung neuer SUMO-Substrate (z. B. des (Na+, K+)/H+-Antiporters Vnx1) ergab diese Analyse eine N-terminale Modifikation von SUMO, vermutlich durch Ubiquitin. Aus physiologischer Sicht wurde die Wirkung des SUMO-Systems auf die Lokalisierung von Dnm1 untersucht. Die Erzeugung einer Ulp2-Variante mit einem Niedrigtemperatur-Degron und die Anwendung eines verbesserten mtGFP-Konstrukts zeigten, dass die Fragmentierung der Mitochondrien im Laufe eines Tages bei restriktiver Temperatur auftritt und daher wahrscheinlich eine Folge der Anhäufung sumoylierter Proteine ist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass speziell im Stamm dnm1∆ fzo1∆, der in der mitochondrialen Dynamik defekt ist, das Fehlen von ULS zu einer verstärkten Bildung von petite-Kolonien führt. Dies wiederum deutet darauf hin, dass ULS insbesondere bei Fehlen der mitochondrialen Qualitätskontrollsysteme der Teilung und Fusion wichtig sind, um die Atmungsfähigkeit zu erhalten. Für Dnm1 selbst konnte eine Ubiquitylierung dieses Proteins nachgewiesen werden. Gleichzeitig scheint eine Sumoylierung von Dnm1 unter den gegebenen Bedingungen jedoch unwahrscheinlich zu sein. Cdc11 konnte erfolgreich als bekanntes SUMO-Substrat eingesetzt werden, was die generelle Eignung der angewandten Methoden bestätigt. In Übereinstimmung mit dem Nachweis von ubiquitylierten Formen wurde festgestellt, dass Dnm1 über das Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut wird. Außerdem wurde Ethanol als eine Behandlung entdeckt, die zum Abbau von Dnm1 führt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die im Rahmen dieser Arbeit etablierten Methoden nützliche Werkzeuge für die Analyse von SUMO-Konjugaten darstellen, und dass die Entdeckung von ubiquityliertem Dnm1 ein Ausgangspunkt für die weitere Analyse dieser Modifikation in Bezug auf die mitochondriale Dynamik sein könnte. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Pabst, Stefan s.pabst.koeln@gmail.com orcid.org/0000-0003-1073-4246 UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-635955
Date:	2021
Place of Publication:	Köln
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language SUMO English Posttranslational modification English Mitochondria English
Date of oral exam:	3 November 2021
Referee:	Name Academic Title Dohmen, Jürgen Prof. Dr. Hofmann, Kay Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/63595