Dissection of EDS1-dependent and salicylic acid-independent defence signalling pathways in Arabidopsis thaliana: a chemical biology approach

Joglekar, Shachi (2014). Dissection of EDS1-dependent and salicylic acid-independent defence signalling pathways in Arabidopsis thaliana: a chemical biology approach. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Plants have to survive in an environment where they are constantly under attack from a wide range of pathogens, and they utilise sophisticated, multi-layered defence mechanisms to resist infection. The Arabidopsis thaliana protein Enhanced disease susceptibility1 (EDS1), together with its signalling partners, Phytoalexin deficient4 (PAD4) and Senescence associated gene101 (SAG101), constitutes a central regulatory hub in plant immunity. EDS1 is essential for basal defence and for effector-triggered immune responses mediated via TIR-NB-LRR (Toll-Interleukin1 receptor-Nucleotide Binding site-Leucine Rich Repeat) receptors. EDS1-dependent signalling can be divided into two branches: a salicylic acid (SA)-dependent branch and a SA-independent branch. Flavin-dependent mono-oxygenase 1 (FMO1) is a marker gene for the EDS1-dependent, SA-independent signalling pathway. FMO1 is dependent on EDS1 and PAD4, and plays a crucial role in basal defence and TIR-NB-LRR-mediated immune responses. However, the mechanistic details of FMO1 signalling and other components involved modulation of EDS1-dependent, SA-independent defence signalling are unknown. I aimed at identifying some of these unknown components, using a chemical biology approach and screening for selective compounds that can be used as tools in applications complementing genetic approaches. The advantage of this method lies in its potential to circumvent problems generally encountered in genetic approaches, such as redundancy of gene function, lethality of mutants and pleiotropic effects. I developed a bi-directional screening procedure for chemicals activating or inhibiting FMO1 accumulation, using a transgenic A. thaliana line expressing a YFP-tagged FMO1 protein under control of the native FMO1 promoter in a fmo1-1 mutant background. Three compounds selectively activating FMO1 expression were identified after screening and verification, from amongst a library of 1488 compounds. The selected chemicals; merbromin, monensin sodium salt, and thaxtomin A, could induce expression of FMO1, independent of SA accumulation, thus confirming the SA-independent nature of FMO1 defence regulation. All three chemicals were extensively tested for their role in modulation of plant immune responses. Merbromin leads to the upregulation of several defence genes known to be linked to FMO1, such as EDS1, PAD4 and Isochorismate synthase1 (ICS1). However, it does not induce accumulation of SA and expression of Pathogenesis related1 (PR1), suggesting that it causes perturbations at several points in the FMO1-related signalling pathway. Monensin sodium salt also leads to an increase in expression of EDS1, PAD4, ICS1 and PR1, along with SA accumulation. Monensin sodium salt activates mitogen-activated protein kinases (MAPKs), which could play a role in induction of FMO1 expression. Thaxtomin A was the most specific modulator of FMO1 signalling, and does not affect early defence responses such as MAPK activation and production of reactive oxygen species. It causes SA accumulation and enhances expression of EDS1, PAD4, ICS1, and PR1. Thaxtomin A-induced FMO1 expression is dependent on EDS1 and PAD4. I found thaxtomin A to be a specific activator of PAD4 expression, with enhanced PAD4 mRNA accumulation, independent of EDS1. There are also indications that PAD4 may have an EDS1-independent role in thaxtomin A-induced FMO1 upregulation. However, the presence of both, EDS1 and PAD4, is essential for maximum upregulation of FMO1 by thaxtomin A. Identification of the molecular target of thaxtomin A may lead to unknown components involved in EDS1-dependent, SA-independent signalling and greater mechanistic knowledge of the signalling pathway.

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Thesis (PhD thesis)

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Abstract

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Pflanzen leben in einer Umgebung in der sie ständigen Angriffen durch Unmengen von Pathogenen ausgesetzt sind. Dabei benutzen Pflanzen hochentwickelte, mehrschichtige Verteidigungsmechanismen um einer Infektion zu widerstehen. Das Protein „Enhanced disease susceptibility1“ (EDS1) bildet zusammen mit seinen Interaktionspartnern „Phytoalexin deficient4“ (PAD4) und „Senescence associated gene101“ (SAG101) eine zentrale regulatorische Einheit in der Signalweitergabe des pflanzlichen Immunsystems von Arabidopsis thaliana. EDS1 ist sowohl unverzichtbar für basale Immunantworten, als auch für Effektor-induzierte Immunantworten, welche durch „Toll-interleukin1 receptor-nucleotide binding site-leucine rich repeat“ (TIR-NB-LRR) Rezeptoren ermöglicht werden. EDS1-vermittelte Signalwege können dabei salicylsäure(SA)-abhängig oder SA-unabhängig sein. Das Gen Flavin-dependent mono-oxygenase1 (FMO1) gilt als Repräsentant des EDS1-abhängigen, SA-unabhängigen Signalwegs. FMO1 benötigt EDS1 und PAD4 und spielt ebenfalls eine entscheidende Rolle für die basale Resistenz und während TIR-NB-LRR-vermittelter Immunantworten. Details der FMO1-übermittelten Signalwege, sowie andere Komponenten die einen Einfluss auf EDS1-abhängige, SA-unabhängige Immunsignalwege haben, sind bis jetzt noch nicht bekannt. Das Ziel meiner Arbeit war diese unbekannten zusätzlichen Komponenten zu identifizieren. Dafür wurde ein chemisch-biologischer Ansatz gewählt der auf einer Selektion chemischer Komponenten basiert, welche eine genetische Komplementation hervorrufen. Der Vorteil dieser Methode besteht in der Vermeidung von häufig auftretenden Problemen genetischer Selektionsansätze, z.B. Redundanz der Genfunktion, hohe Sterblichkeitsrate der Mutanten oder pleiotropische Effekte. Ich habe ein bidirektionales Selektionsverfahren entwickelt, wodurch chemische Substanzen die eine Akkumulation von FMO1 anregen bzw. verhindern mit Hilfe einer transgenen A. thaliana Linie, welche ein YFP-markiertes FMO1 Protein unter seinem nativen Promoter im fmo1-1 Mutantenhintergrund exprimiert, identifiziert werden konnten. Aus einer Sammlung von 1488 chemischen Substanzen konnten drei Chemikalien identifiziert und verifiziert werden, welche die Aktivierung der FMO1 Expression hervorriefen. Alle drei Komponenten: Merbromin, Monensin-Natriumsalz und Thaxtomin A, induzierten die FMO1 Expression unabhängig von einer SA Akkumulation, was ebenfalls eine SA-unabhängige Regulation von FMO1 bestätigt. Daraufhin wurde der Effekt der drei Chemikalien auf pflanzliche Immunantworten untersucht. Merbromin führte zur Induktion von verschiedenen FMO1 verbundenen Abwehrgenen, wie beispielsweise EDS1, PAD4 und „Isochorismate synthase1“ (ICS1). Jedoch führte es nicht zu einer Erhöhung des SA Gehalts oder der Genexpression von „Pathogenesis related1“ (PR1), was darauf deutet, dass es verschiedenen Stellen in FMO1-regulierten Signalwegen stören kann. Monensin-Natriumsalz bewirkte neben der Expressionsinduktion von EDS1, PAD4, ICS1 und PR1 auch eine Anreicherung von SA. Monensin-Natriumsalz aktiviert die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPKs), welche eine Rolle in der Induktion der FMO1 Expression spielen könnten. Thaxtomin A wirkte am spezifischsten auf FMO1-vermittelte Signalwege und hatte keinen Einfluss auf frühe Immunantworten, wie beispielsweise die Aktivierung der MAPKs oder die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies. Es bewirkt die Anreicherung von SA und eine erhöhte Expression von EDS1, PAD4, ICS1 und PR1. Die von Thaxtomin A-induzierte FMO1 Expression ist abhängig von EDS1 und PAD4. Dabei habe ich ermittelt, dass Thaxtomin A auch ein spezifischer Aktivator der PAD4 Expression ist, wodurch es zur erhöhten Anreicherung von PAD4 mRNA unabhängig von EDS1 kommt. Weitere Hinweise deuten auf eine EDS1-unabhängige Funktion von PAD4 während der Thaxtomin A-induzierten FMO1 Expression. Eine maximale Induktion der FMO1 Expression durch Thaxtomin A ist jedoch nur möglich, wenn sowohl EDS1 als auch PAD4 vorhanden sind. Die Identifikation des molekularen Angriffsziels von Thaxtomin A könnte die bis jetzt unbekannten Komponenten des EDS1-abhängigen, SA-unabhängigen Signalweges aufzeigen und unser Verständnis über Prozesse dieser Signalweiterleitung erweitern.

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