Universität zu Köln

Liu, Chun-Hsin (2015). The study of DNA damage repair in Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

DNA is the major storage of genetic information common to all cellular organisms. Endogenous and exogenous factors may damage DNA and affect plant growth and fitness. To dissect the genetic variation of Arabidopsis thaliana to DNA replication stress, 400 Arabidopsis natural accessions were exposed to hydroxyurea (HU), a drug interfering with deoxyribonucleotide synthesis. This revealed a great variation in relative survival of Arabidopsis accessions to HU. However, extremely hypersensitive accessions were rare. To identify the molecular basis of this natural variation, quantitative trait locus (QTL) mapping with the recombinant inbred line population derived from crosses between HU-sensitive and resistant parents was performed. Two significant QTLs with additive effects and one minor QTL with epistatic effect were identified. Using heterogeneous inbred family analysis, one QTL was validated and fine mapped to a 22 kb region containing eight candidate genes which require further analysis. Genes involved in related biological processes or pathways are often expressed coordinately, thus the uncharacterized candidate genes might be co-expressed with the functionally known genes. This co-expression strategy was applied to search for novel DNA damage repair genes in Arabidopsis and revealed increased sensitivity of mutants in CHROMATIN REMODELING 31 to DNA inter-strand cross-linker, mitomycin C. Furthermore, the chr31 mutant showed delayed cell cycle progression and increased frequencies of somatic homologous recombination (HR). This provides a novel connection between chromatin remodeling and DNA damage responses by so far unknown mechanisms. Nucleoside analogues are frequently used in basic and medical research. However, their mode of action and spectra of effects are not well understood. Analysis of the molecular effects of non-methylable cytidine analogue zebularine in Arabidopsis revealed induction of DNA damage response, post-replicative cell cycle arrest, and increased endoreduplication, but without obvious changes in DNA methylation. Molecular and genetic data suggested that zebularine-induced damage specifically occur during DNA replication in the course of DNA strand synthesis. The signaling of this damage was mediated by additive activity of ATAXIA TELANGIECTASIA MUTATED and ATAXIA_TELANGIECTASIA MUTATED AND RAD3-RELATED kinases. The repair required a functional STRUCTURAL MAINTENANCE OF CHROMOSOMES (SMC) 5-SMC6 complex and was accomplished predominantly by synthesis-dependent strand annealing type of HR. Hence, commonly used “epigenetic inhibitor” zebularine causes specific type of DNA damage.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language DNA ist der wichtigste Träger der Erbinformationen für alle zellulären Organismen. Endogene und exogene Faktoren können Schädigungen der DNA verursachen und damit das Pflanzenwachstum und die Anpassungsfähigkeit beeinträchtigen. Um die genetische Variation im Zusammenhang von DNA-Replikationsstress in Arabidopsis thaliana zu untersuchen, wurden 400 A. thaliana Ökotypen der Chemikalie Hydroxyurea (HU), einem Stoff der die DNA-Synthese behindert, ausgesetzt, was deutliche Unterschiede in der Überlebensrate von verschiedenen Arabidopsis Ökotypen aufdeckte. Um die genetische Grundlage dieser Unterschiede zu identifizieren, wurden QTL-Kartierungen mit einer rekombinanten Inzuchtline durchgeführt, die aus der Kreuzung einer HU-sensitiven mit einer HU-resistenten Linie abstammt. Dabei wurden zwei signifikante QTLs ermittelt, die additive Effekte aufwiesen, und ein weiterer QTL der epistatische Effekte aufwies. Mit Hilfe von heterogenen Inzuchtlinien konnte einer dieser QTLs validiert werden und durch eine Feinkartierung die Region auf 22 kb und insgesamt 8 Kandidatengene eingegrenzt werden. Gene, die in ähnlichen oder zusammenhängenden biologischen Prozessen eingebunden sind, werden oftmals koordiniert exprimiert. Daher können durch Untersuchungen der Expression von nicht charakterisierten Genen und ihrer Koexpression mit bereits bekannten Genen Rückschlüsse auf deren Funktion geschlossen werden. Mit dieser Herangehensweise wurde das bisher in diesem Zusammenhang uncharakterisierte DNA-Reparaturgen CHROMATIN REMODELING 31 identifiziert, welches eine erhöhte Sensitivität gegenüber der Chemikalie Mitomycin C aufwies, einem Stoff der zu einer erhöhten Anzahl von intermolekularen Bindungen zwischen zwei DNA-Moleküle führt. Des weiteren zeigten chr31 Mutanten einen verzögerten Zellzyklus und erhöhte Raten homologer Rekombination in somatischen Zellen. Damit konnte ein neuer Zusammenhang zwischen Chromatin-Remodellierung und DNA-Reparatur hergestellt werden. Nukleosidanaloga werden häufig in der Grundlagenforschung angewendet, jedoch ohne ihren genauen Wirkungsmechanismus zu kennen. Daher wurden Untersuchungen zum molekularen Wirkungsmechanismus des nicht methylierbaren Cytidinanalogons Zebularin in Arabidopsis durchgeführt. Diese zeigten, dass Zebularin die DNA-Reparaturantwort induziert, zum Stopp des Zellzyklus nach Replikation führt und die Endoreduplikationsrate erhöht, ohne dabei die DNA-Methylierung sichtbar zu beeinflussen. Molekulare und genetische Daten deuten darauf hin, dass durch Zebularin induzierte DNA-Schäden spezifisch während der Synthese der DNA-Stränge im Verlauf der DNA-Replikation auftreten. Die Signalweiterleitung dieser Schädigungen wird additiv durch die Aktivität der Kinasen ATAXIA TELANGIECTASIA MUTATED und TAXIA_TELANGIECTASIA MUTATED AND RAD3-RELATED vermittelt. Außerdem wird für die Reparatur ein funktionsfähiger STRUCTURAL MAINTENANCE OF CHROMOSOMES (SMC) 5-SMC6 Komplex benötigt. Die Reparatur selbst erfolgt überwiegend in Form des synthesis-dependent strand annealing der homologen Rekombination. Somit konnte gezeigt werden, dass Zebularin spezifisch Schäden an der DNA verursacht. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Liu, Chun-Hsin phoebeliu0920@hotmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-65063
Date:	April 2015
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Arabidopsis UNSPECIFIED
Date of oral exam:	18 June 2015
Referee:	Name Academic Title Koornneef, Maarten Prof. Dr. Björn, Schumacher Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6506