Universität zu Köln

Gollwitzer, Peter Urs Gottfried ORCID: 0000-0002-5145-6898 (2023). Role of the Rag GTPases in Amino Acid sensing and mTORC1 signaling. PhD thesis, Universität zu Köln.

PDF Peter_Gollwitzer_PhD Thesis.pdf Download (462kB)

Abstract

To sustain metabolism and homeostatic functions, cells need to acquire energy-rich nutrients from their environment. These are broken down in catabolic pathways to provide energy for ATP generation. Nutrients are also the building blocks of complex biomolecules and effectively define the composition of biomass. To balance energy metabolism and biomass production cells need to be able to switch from catabolic to anabolic metabolism. This switch is regulated by the kinase mTOR, which was identified as the target of the immunosuppressant Rapamycin. mTOR was shown to react cell-autonomously to amino acid availability by upregulating translation and downregulating autophagy. Beyond this, mTOR was demonstrated to upregulate various other anabolic pathways, with major implications for human disease and the ageing process. The proteins that facilitate mTOR activation in response to amino acids are the dimeric Rag GTPases, which are localized at the lysosomal surface. An active dimer is composed of a smaller and larger Rag monomer, however there are two paralog genes for the smaller (Rag A and RagB) and the larger (RagC and RagD) monomer. Although many regulators of the Rag GTPases have been identified, the role of paralog Rag GTPase genes has not been thoroughly investigated. Our hypothesis was that the paralog Rag GTPase proteins are non-redundant and facilitate different signaling events in the mTORC1 pathway. We tested this hypothesis by using gene editing tools to knock-out endogenous Rag GTPase genes, obtaining a quadruple knock-out cell line. We used this cell line for a reconstitution approach, in which we re-expressed all four possible Rag dimer combinations. We performed functional mTOR assays and were able to report novel, non-redundant functions of the paralogs. All dimer combinations rescued phosphorylation of the substrate S6K, which controls translation. However, only the Rag GTPase dimers containing the RagD paralog are able to rescue the phosphorylation of lysosomal transcription factors TFEB and TFE3. We investigated TFE3-dependent transcription and were able to confirm a downregulation by RagD-, but not RagC-containing dimers. We studied the regulatory mechanism of substrate specificity and found stronger localization of RagD-containing dimers at the lysosomal surface. We identified the regions of the RagD protein that enable it to regulate the subset of lysosomal mTOR substrates. Moreover, we discovered that cancer-associated gain-of-function mutations enabled the paralog RagC protein to also facilitate lysosomal substrate phosphorylation. Finally, we demonstrated, that the RagB, but not the RagA paralog rendered mTOR activity resistant to amino acid starvation. We identified a novel mode of regulating mTOR substrate selectivity and amino acid response. Thus, we were able to uncover a whole new level of mTOR regulation by the paralogs of Rag GTPases with major implication for the pathways’ function.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Zellen sind auf die Aufnahme von energiereichen Nährstoffen aus der Umgebung angewiesen, um essentielle Stoffwechselfunktionen aufrechterhalten zu können. Die Nährstoffe werden in katabolen Stoffwechselwegen abgebaut um Energie in Form von ATP zu generieren. Gleichzeitig handelt sich bei den Nährstoffen um die Bausteine komplexer Biomoleküle, die für die Zusammensetzung sämtlicher Biomasse essentiell sind. Um Energiestoffwechsel und den Aufbau der Biomasse zu balancieren, müssen Zellen in der Lage sein bei ausreichendem Nährstoffangebot anabole Stoffwechselwege aktivieren zu können. Dieser Übergang wird durch die Proteinkinase mTOR kontrolliert, welche ursprünglich als pharmakologisches Ziel des Immunsuppressivums Rapamycin identifiziert wurde. mTOR wird auf zellautonome Weise durch Aminosäuren aktiviert, sodass die Translation durch mTOR hoch- und die Autophagie herunterreguliert werden kann. Darüber hinaus konnte eine Beteilung von mTOR an zahlreichen Stoffwechselwegen und eine zentrale Rolle im Alterungsprozess und bei der Entstehung von Krankreiten gezeigt werden. Die dimeren Rag GTPasen sind Proteine, die mTOR bei steigenden Leveln von Aminosäuren aktivieren und sich an der Oberfläche der Lysosomen befinden. Ein aktiver Rag GTPase Dimer besteht aus jeweils einem kleineren und einem größeren Rag GTPase Monomer. Das menschliche Genom enthält jedoch jeweils zwei paraloge Gene für das kleinere (RagA und RagB) und das größere (RagC und RagD) Rag GTPase Protein. Trotz ausgiebiger Forschung am mTOR Signalweg, ist die Rolle der paralogen Rag GTPasen niemals systematisch untersucht worden. Unsere Hypothese war, dass die paralogen Rag GTPase Proteine nicht beliebig austauschbar sind, sondern definierte regulatorische Rollen im mTOR Signalweg übernehmen. Wir haben diese Fragestellung in einer Zelllinie untersucht, deren endogene Rag GTPasen mittels CRISPR-Cas9 ausgeschaltet wurden. Die Zelllinie wurde mit den 4 möglichen dimeren Kombinationen der paralogen Rag GTPasen rekonstituiert. Wir haben funktionale mTOR-Assays durchgeführt und dabei bisher unbekannte, spezifische Funktionen der paralogen Rag GTPasen gefunden. Alle vier Rag GTPase Dimere waren in der Lage die Phosphorylierung des mTOR Substrats S6K zu regulieren, welches die Translation kontrolliert. Jedoch waren nur die Dimere, welche das RagD Protein enthielten, in der Lage die Phosphorylierung der lysosomalen Transkriptionsfaktoren TFEB und TFE3 auszulösen. Eine Untersuchung der Transkription bestätigte, dass die Substrate des Transkriptionsfaktors TFE3 durch RagD negativ reguliert werden. Der regulatorische Mechanismus dieser Substratspezifität lag in einer verstärken Lokalisierung der RagD enthaltenden Dimere am Lysosom begründet. Wir konnten die Regionen des RagD Proteins identifizieren, die diese Art der Regulation ermöglichen. Außerdem konnten wir zeigen, dass in Krebszellen auftretende Mutationen im paralogen RagC Protein ebenfalls die negative Regulation der lysosomalen mTOR-Substrate ermöglichten. Weiterhin konnten wir zeigen, dass das RagB-, jedoch nicht das RagA-Paralog des kleineren Rag GTPase Monomers den mTOR Signalweg unempfindlich gegen Aminosäuremangel macht. Somit konnten wir die Existenz einer neuen Ebene der Regulation des mTOR-Signalweges nachweisen. UNSPECIFIED
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Gollwitzer, Peter Urs Gottfried pgollwi1@uni-koeln.de orcid.org/0000-0002-5145-6898 UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-653071
Date:	3 April 2023
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Biology of Ageing
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language mTORC1 signaling English Nutrient sensing English Lysosome English
Date of oral exam:	19 September 2022
Referee:	Name Academic Title Demetriades, Constantinos Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/65307