Universität zu Köln

Schulze, Anne Viktoria (2023). Systematic evaluation of techniques for the study of the supramolecular architecture of rhodopsin. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The eye is outstanding in its sensitivity: it can react to single photons due to the rod photoreceptor, in particular its outer segment. This thesis investigates experimental approaches to study the higher-order structure of the outer segment’s crucial constituent: rhodopsin. The oligomeric state and organization of rhodopsin within disk membranes has been discussed intensively due to its fundamental meaning. The method of choice to analyze rhodopsin in its close-to-native state so far has been cryo-electron microscopy of vitreous sections (CEMOVIS). To analyze one illumination state of rhodopsin (dark state), CEMOVIS was sufficient. However, CEMOVIS has the disadvantage to be time-consuming and error-prone. To analyze different illumination states, CEMOVIS is not efficient enough. The main part of this thesis treats alternative techniques to overcome the disadvantages of CEMOVIS. Additionally, studies of rhodopsin’s temporal bleaching behaviour were carried out. In more detail: First, we aim to analyze the bleaching of intact retinas. This was done quantitatively via UV-VIS-spectroscopy. We could see an exponential bleaching within the short time scale (in the range of ms). Second, alternative techniques to substitute CEMOVIS were considered and their applicability investigated and evaluated. Dual-axis tomography for tomogram acquisition of samples produced via CEMOVIS turned out to be suboptimal. A ROS solubilization prior to cryo-fixation was accompanied by the same disadvantages like CEMOVIS of high-pressure-frozen retinas. The retinal misplacement and thereby the oblique fractioning of ROS during freeze-fracture experiments with retinal cryo-samples impeded direct imaging of exposed ROS disk membranes. Samples for cryo-ET can also be produced with the focused-ion beam (FIB). Tomography is sped up by using the Fib , due to superior sample quality. However, this way to produce samples is again suboptimal and time-consuming at the present. The most promising approach was to reduce dimensionality of the sample via isolation of ROS disks. ROS disks can subsequently be used for vitrification (plunge-freezing) and subsequent cryo-ET or analyzed via atomic force microscopy (AFM). AFM however, does not allow the investigaion of close-to-native state samples. Nevertheless, it has the advantage of being a technique with a greater effectiveness – what we aimed for. A future optimization of this technique will allow for further investigations of, for example, rhodopsin’s supramolecular structure upon illumination. Finally, a tomogram was simulated and compared to real data.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Sensitivität des Auges ist einmalig: dank der Stäbchen, insbesondere ihrer Außensegmente, kann es bereits auf einzelne Photonen reagieren. Diese Arbeit befasst sich mit verschiedenen Methoden, um die Organisation des wichtigsten Bestandteils des Außensegmentes zu untersuchen: dem Rhodopsin. Die Frage nach der Oligomerisierung und Organisation von Rhodopsin wurde aufgrund seiner grundlegende Bedeutung weithin untersucht und diskutiert. Kryoelektronenmikroskopie von Gefrierschnitten (CEMOVIS) ist die Methode der Wahl, um Rhodopsin in seinem nativen Zustand zu untersuchen. Für die Untersuchung eines Belichtungszustandes von Rhodopsin war CEMOVIS geeignet. Doch hat CEMOVIS den Nachteil, zeitaufwendig und fehleranfällig zu sein. Um verschiedene Belichtungszustände zu untersuchen, war CEMOVIS aufgrund der geringen Effektivität nicht geeignet. Der Hauptteil dieser Doktorarbeit befasst sich mit alternativen Techniken, um die Nachteile von CEMOVIS zu überwinden. Zusätzlich wurde das zeitliche Verhalten von Rhodopsin beim Bleichen durch Lichteinwirkung untersucht. Im Detail: Als Erstes wurde das Bleichen der intakten Retina untersucht. Dies wurde quantitativ mittels UV-VIS-Spektroskopie gelöst. Für kurze Belichtungszeiten (im ms- Bereich) zeigte sich ein exponentielles Bleichen von Rhodopsin. Als Nächstes wurden alternative Techniken als Ersatz für CEMOVIS hinsichtlich ihrer Machbarkeit betrachtet und bewertet. Die Tomographie über zwei Achsen von CEMOVIS-Proben stellte sich als unpraktikabel heraus. Wenn die Außensegmente vor der Kryofixierung isoliert wurden, brachte dies die gleichen Nachteile wie CEMOVIS mit kryofixierten Retinas mit sich. Während der Gefrierbruch-Experimente zeigte sich, dass die Retinen nicht eben liegend eingefroren waren. Dadurch waren die Membransäckchen der Außensegmente durch die schiefen Gefrierbrüche nicht analysierbar. Proben für die Tomographie lassen sich auch über die Ionenfeinstrahlanlage herstellen. Die Tomographie beschleunigt sich dadurch, weil die Probenqualität höher ist. Auch die Etablierung dieser Methode zeigte schwerwiegende zeitliche Nachteile auf. Vielversprechend war der Ansatz, die Dimensionalität der Probe durch Isolaton der Außensegmente und anschließend der enthaltenen Membransäckchen zu reduzieren. Diese lassen sich kryofixieren und tomographieren oder über ein Rasterkraftmikroskop analysieren. Dies lässt sich jedoch nicht mit dem nativen Zustand der Probe vereinbaren. Dennoch bringt das Rasterkraftmikroskop den Vorteil einer höheren Effektivität mit sich – das Ziel der Arbeit. Eine zukünftige Optimierung der Technik kann weitere Untersuchungen ermöglichen, z.B. die supramolekulare Struktur von Rhodopsin unter Belichtung. Schließlich wurde ein Tomogram simuliert und mit den aufgenommenen Realdaten verglichen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Schulze, Anne Viktoria schulze_anne@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-653954
Date:	2023
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Externe Einrichtungen
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Rhodopsin English Cryo-EM English Supramolecular structure English
Date of oral exam:	1 June 2022
Referee:	Name Academic Title Behrmann, Elmar Prof. Dr. Baumann, Ulrich Prof. Dr. Kaupp, Ulrich Benjamin Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/65395