Universität zu Köln

Schnitzler, Alexander (2016). Proteinkinase CK2: ein Enzym mit mehreren Bindestellen. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

CK2 ist eine eukaryotische Proteinkinase der CMGC-Familie. Durch ihre pleiotrope Funktion, die ubiquitäre Lokalisation und ihre konstitutive Aktivität (in vitro) ist sie ein wichtiges Element in vielen Signalkaskaden. CK2 liegt in der Zelle sowohl als heterotetrameres Holoenzym (bestehend aus zwei katalytischen CK2a-Untereinheiten und zwei regulatorischen CK2b-Untereinheiten) als auch als monomeres CK2a-Protein vor und kann sowohl ATP als auch GTP als Phosphodonor verwenden, ein Alleinstellungsmerkmal unter CMGC-Kinasen. Die Bedeutung dieser seit vielen Jahrzehnten bekannten Serin/Threonin-Proteinkinase für zentrale Prozesse in der Zelle wurde in den letzten Jahrzehnten immer deutlicher. CK2 hat unter anderem eine wichtige antiapoptotische Funktion, die Krebszellen vor dem Zelltod schützt. Sowohl wegen ihrer außerordentlichen Eigenschaften als auch durch die medizinische Relevanz ist CK2 Objekt intensiver Forschung. Um einen Beitrag zu den noch offenen Fragen zu leisten, habe ich mich in dieser Arbeit mit den Bindestellen des katalytischen CK2a-Monomers beschäftigt. Ich konnte zeigen, dass kleine Unterschiede innerhalb der neuartigen ATP-kompetitiven Töberichfuran-Inhibitoren einen erheblichen Anteil an der Orientierung dieser Inhibitoren an der ATP-Bindestelle haben und dass ein weiterer ATP-kompetitiver Inhibitor (E9) ein außergewöhnliches Bindungsmuster aufweist. Der als Bisubstratinhibitor entwickelte Inhibitor ARC3140 zeigte in der Kristallstruktur mit CK2a die überraschende Eigenschaft mit dem ATP-kompetitiven Anteil sowohl an der ATP-Bindetasche als auch an der CK2a/b-Interaktionsstelle im Kristall zu binden. Diese Bindung an der CK2a/b-Interaktionsstelle wurde näher charakterisiert und ist kein Kristallisationsartefakt, sondern findet ebenfalls in Lösung statt. Durch die Kristallisation einer symmetrischen Holoenzymstruktur konnte ich einen Beitrag zum Verständnis der Oligomerisation von CK2 leisten. CK2b bindet nicht ausschließlich an der primären CK2a/b-Interaktionsstelle. Es ist ebenfalls eine Affinität für die sekundäre Interaktion der sauren Schleife von CK2b im Holoenzym zu der basischen Substratbinderegion von CK2a eines anderen Holoenzyms vorhanden. Diese Affinität gibt der länger diskutierten Möglichkeit der Filamentbildung eine strukturelle Basis. Die N- und C-terminalen Domänen von CK2a werden durch die Gelenkregion an der ATP-Bindetasche miteinander verbunden. Das monomere humane CK2a-Protein ist bislang das einzige CK2a-Protein, bei dem diese Gelenkregion sowohl in einer offenen als auch in einer geschlossenen Konformation kristallisiert wurde. Um einen Einblick in die Funktion dieser Konformationen zu erhalten, wurden vier Proteinvarianten kristallisiert. Durch die Verknüpfung der Strukturdaten mit Kinetiken dieser Proteinvarianten konnte die Bedeutung einzelner Aminosäurereste für die Konformation herausgestellt werden. Die Kristallisation von CK2a mit dem substratkompetitiven Inhibitor Heparin konnte erstmalig die Bindung eines größeren Moleküls an die Substratbindestelle von CK2a zeigen. Außerdem konnte eine zweite Bindungsstelle für Heparin identifiziert werden und daraus ein Modell für die Heparinbindung an CK2a im Einklang mit Kinetikdaten der CK2-Literatur postuliert werden.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language CK2 is an eucaryotic protein kinase of the CMGC-family. Due to its pleiotropic function, the ubiquitious localization and a constitutive in vitro activity, CK2 is an essential element of many signalling cascades. In the cell, CK2 exists as a heterotetrameric holoenzyme (consisting of two catalytic CK2a-subunits and two regulatory CK2b-subunits) but also as monomeric CK2a-protein and CK2a can either use ATP or GTP as phosphodonor, which is an outstanding feature for a CMGC-kinase. Identified decades ago, the importance of this serine/threonine-protein kinase became increasingly clear over the last twenty years. Amongst other functions, CK2 has an important antiapoptotic role which can lead to cell survival in cancer cells. Because of its extraordinary properties and the medical relevance, CK2 has been subjected to intense research. In order to answer open questions, my work focused on the binding sites of the catalytically active monomeric CK2a. I could show that small differences within the recently discovered ATP-competitive Töberichfuran-inhibitors have a significant impact on the orientation of the inhibitor within the ATP binding site. Another ATP-competitive inhibitor (E9) shows an extraordinary mode of binding. Initially developed as a bisubstrate inhibitor, ARC3140 has the unexpected property to not only bind within the ATP binding site but additionally at the CK2a/b interaction interface within the crystal structure. This extraordinary binding was further characterized and is not merely a crystallisation artifact but also detectable in solution. I could also contribute to the understanding of the oligomerisation of CK2 by crystallization of a symmetric holoenzyme structure. CK2b did not only bind to the primary CK2a/b interaction site but also formed a secondary interaction between its acidic loop and the basic substrate binding site of CK2a from another Holoenzyme. This affinity provides a structural basis for a widely discussed filament formation of CK2. To get an insight into the function of the two known conformations of the hinge region that connects the N- and C-terminal Domain, four protein variants were crystallised. This open and closed conformation had only been shown for human CK2a crystal structures. Integrating structural and kinetic data, I was able to highlight the importance of individual sidechains for the two different conformations. The cocrystallisation of CK2 with the substrate-competitive inhibitor heparin is the first structure which includes the binding of a larger molecule to the substrate binding site of CK2a. Moreover, I was able to identify a second heparin binding site and to postulate a model for heparin binding to CK2a in agreement with known kinetic data from the CK2-literature. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Schnitzler, Alexander alexander.schnitzler@posteo.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-66641
Date:	2016
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut II für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language CK2, Proteinkinase, Inhibition, Heparin, Interaktion German
Date of oral exam:	7 December 2015
Referee:	Name Academic Title Niefind, Karsten Prof. Dr. Baumann, Ulrich Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6664